建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

韦锦源，刘丹，杨静贤，李孜，钟青萍

（广东省食品质量与安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

食源性疾病是一类通过摄取食物使致病因子进入体内而引起感染或中毒的常见人类疾病[1-2]，其在全球范围内造成严重的公共卫生负担，对经济及社会发展均造成了不利影响[3-4]。根据世界卫生组织2020年数据显示，全世界每年有5.5亿人因食用受污染的食物而患病，其中约23万人死亡[5]。食源性致病菌是引起食源性疾病的一大原因[6-7]，其中单增李斯特氏菌是常见致病菌，它广泛存在于环境、食品、人和动物宿主中，可以在极端条件下生存并引起食物污染，食用被该菌污染的食物会引起李斯特菌病，致死率高达20%～30%，对公共卫生安全危害较大[8-9]。对于常见致病菌的检测，传统培养方法仍是公认且可靠的方法，但需要经过细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定等多个步骤，较为繁琐[10-12]；常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法因检测时间较长而受限。基于免疫学技术的检测不能区分死活细胞[13]。

环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是由 Notomi等[14]于 2000 年提出的一种核酸扩增技术，可在恒温的条件下对靶基因进行检测[15-16]，但是常规的LAMP方法需要扩增完成后进行染色，容易形成气溶胶污染[17]；依靠对反应过程或终点进行荧光染色的荧光环介导等温扩增（real-time loopmediated isothermal amplification，real-time LAMP）可较好地解决此问题[18]，但荧光染料染色易造成假阳性，因此寻求一种更精准、便捷的染色方法显得至关重要。基于淬灭基团释放环介导等温扩增技术（detection of amplification by release of quenching-LAMP，DARQLAMP）是在一条内引物的5’端修饰荧光基团（或淬灭基团），并加入一条与上游内引物（forward inner primer，FIP）中的F1c部分互补且3’端修饰淬灭基团（或荧光基团）的探针，该探针在反应前需预先与内引物进行孵育，使探针与内引物杂交形成淬灭探针双链（quenching probe double chain，QPD），使得荧光处于淬灭状态，当聚合酶遇到双链，探针就会移位并产生荧光信号[19]。DARQ-LAMP方法具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但未有检测单增李斯特菌的研究报道[20-22]。本文针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物[23]，优化反应条件，建立real-time LAMP方法，并在此基础上进一步建立DARQ-LAMP方法，提高检测效率，为LAMP检测食源性致病菌的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

目标菌株：单增李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 19115），以及非目标菌株：斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri ATCC 35967）、英诺克李斯特菌（Listeria innocua ATCC 33090）、伊氏利斯特菌（Listeria ivanovii ATCC19119）、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri ATCC 12022）、屎肠球菌（Enterococcus faecium ATCC 29212）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis CGMCC 26069）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes ATCC 13048）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis CGMCC 1.1869）、马红球菌（Rhodococcus equi ATCC 6939），均于华南农业大学食品质量与安全实验室保藏。

柱式细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（B518255）、溶菌酶、Bst DNA 聚合酶、Taq PCR Master Mix、Bst LF DNA Polymerase、10×ThermoPol缓冲液、MgCl2溶液、dNTP Mixture、灭菌双蒸水：中国上海生工（生物工程）股份有限公司；Eve Green（20×水溶液）：中国翌圣生物科技（上海）有限公司；胰蛋白胨、Baird-Parker琼脂基础、PALCAM琼脂粉、脑心浸出液肉汤培养基、大豆蛋白胨：中国广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FormaClassⅡ生物安全柜：美国Thermo公司；THZ-100恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；CFX 96TM荧光定量PCR仪：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；SP-02生化培养箱：广州市绿向生物科技有限公司；VORTEX-3涡旋振荡器：上海金鹏分析仪器有限公司；TP600梯度PCR仪：日本Ta-KaRa仪器有限公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度计、5417R高速冷冻离心机：美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；AF100制冰机：意大利SCOTSMAN公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的培养

保藏于-80℃的单增李斯特菌在脑心浸出液肉汤培养基中，150 r/min活化16 h备用，其余菌株于胰蛋白胨大豆肉汤培养基中37℃、150 r/min活化16 h。

1.3.2 DNA模板的制备

采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取模板DNA，具体步骤按照柱式细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（B518255）说明书进行。

1.3.3 LAMP引物和探针的设计与合成

从GenBank数据库获得单增李斯特菌（GenBank：HM589597.1）的基因序列，基于序列信息和相关前期研究，使用LAMP引物设计工具Primer Explorer V5（https：//primerexplorer.jp/e/）针对特异性基因hlyA进行引物设计。最终确定的引物和探针由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。荧光基团为FAM、淬灭基团为BHQ-1、荧光最大激发波长为494 nm、荧光最大发射波长为518 nm、淬灭剂的淬灭范围为480 nm～580 nm。

表1 LAMP引物和探针序列Table 1 LAMP primers and probe sequences

1.3.4 以hlyA为靶基因建立检测单增李斯特菌的real-time LAMP

以单增李斯特菌标准菌株进行real-time LAMP反应，以非目标菌株做阴性对照。优化前的real-timeLAMP反应体系（25 μL）包括：F3 与 B3 各 0.2 μmol/L，FIP 与下游内引物（backward inner primer，BIP）各 1.6 μmol/L，脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTPs）1.6 mmol/L，Mg2+6 mmol/L，Bst DNA 聚合酶 8 U，10×Reation Buffer 2.5 μL，20×EvaGreen 水溶液 1 μL，DNA模板1 μL，空白对照以等量ddH2O代替，补充无菌ddH2O至25 μL。反应条件：65℃1 min，共60个循环，每个循环结束时采集荧光信号；反应结束后80℃灭酶2 min；并对扩增产物进行熔解曲线分析。

1.3.4.1 反应温度优化

分别将反应温度设置为61、63、65、67℃，其他条件保持不变，进行real-time LAMP反应。

1.3.4.2 内外引物浓度比优化

将外引物浓度固定为0.2 μmol/L，根据内外引物浓度比为 4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1共设置 5组试验组，反应体系中的其他成分保持不变，进行real-time LAMP反应。

1.3.4.3 Mg2+浓度优化

将 Mg2+浓度分别设定为 2、4、6、8 mmol/L，其他条件保持不变，进行real-time LAMP反应。

1.3.5 real-time LAMP检测方法特异性验证

分别以单增李斯特氏菌标准菌株以及12株非目标菌株对所建立的real-time LAMP体系进行特异性的验证。荧光扩增曲线为“S”型或类“S”型则判定为阳性。

1.3.6 real-time LAMP检测方法灵敏度

以10倍梯度稀释单增李斯特氏菌标准菌株的DNA为模板，以dd H2O作为空白对照，根据优化后的反应条件进行real-time LAMP，确定方法的灵敏度。

1.3.7 DARQ-LAMP方法的建立

QPD探针的孵育：20 μmol/L内引物/探针与20 μmol/L标记的探针/内引物等体积混合均匀，用锡纸避光包裹，98℃恒温金属浴2 min，自然冷却至室温26℃，分装于1.5 mL离心管中，于-20℃冰箱保存。

优化前DARQ-LAMP反应体系（20μL）：1.6 μmol/L BIP（0.8 μmol/L BIP 和 0.8 μmol/L QPD），1.6 μmol/L FIP，F3 与 B3 各 0.2 μmol/L，Bst DNA 聚合酶 0.32 U/μL，10×Reation Buffer 2 μL，dNTPs 1.4 mmol/L，Mg2+8 mmol/L，DNA模板1.6 μL，补充无菌蒸馏水至20 μL。反应条件设置为65℃1 min，共60个循环，每个循环结束时采集荧光信号；反应结束后80℃灭酶2 min。

1.3.7.1 Bst DNA聚合酶的筛选

选择Bst DNA聚合酶（大片段）、Bst DNA 2.0聚合酶和Bst DNA 3.0聚合酶进行DARQ-LAMP反应，考察DARQ-LAMP扩增曲线和扩增效率。

1.3.7.2 QPD探针浓度优化

由于加入荧光基团和淬灭基团，使整个反应体系更为复杂，QPD在一定的浓度下会抑制LAMP扩增，因此，分别将QPD探针浓度设置为体系的0%、10%、25%、50%、75%、100%，以确定适宜的浓度。

1.3.7.3 Mg2+浓度优化

将 Mg2+浓度分别设定为 2、4、6、8 mmol/L，反应体系中其他组成保持不变，进行实时DARQ-LAMP反应。

1.3.8 DARQ-LAMP特异性的评价

以单增李斯特氏菌标准菌株以及12株非目标菌株进行DARQ-LAMP反应，对方法的特异性进行验证。荧光扩增曲线为“S”型或类“S”型则判定为阳性。

1.3.9 DARQ-LAMP灵敏度的评价

分别以10倍梯度稀释的目标菌株DNA为模板，以ddH2O为空白对照，根据优化后的反应条件进行DARQLAMP反应，确定方法的灵敏度。

1.4 数据处理

试验平行进行3次，荧光定量PCR仪中导出LAMP反应扩增曲线，利用GraphPad Prism 8和Origin进行图像处理分析。

2 结果与分析

2.1 建立检测单增李斯特菌的real-time LAMP

2.1.1 反应温度优化结果

基于hlyA的real-time LAMP的反应温度的优化结果见图1。

图1 基于hlyA的real-time LAMP反应温度的优化Fig.1 Optimization of the reaction temperature for real-time LAMP based on hlyA

由图1可知，在63℃时循环数阈值（cycle threshold，Ct）值最小，且荧光值最大，为检测单增李斯特菌的最适宜温度，此外，温度为67℃时反应无法进行。

a、b、c、d 分别为 61、63、65、67 ℃下的反应结果。

2.1.2 内外引物浓度比优化结果

基于hlyA的real-time LAMP内外浓度比的优化结果见图2。

图2 基于hlyA的real-time LAMP反应内外引物比的优化Fig.2 Optimization of inner to outer primer ratio for real-time LAMP based on hlyA

由图2可知，当内外引浓度物比为6∶1时，反应的Ct值最小，扩增产物荧光值最高，因此该方法的适宜内外引物浓度比为6∶1。

2.1.3 Mg2+浓度优化结果

基于hlyA的real-time LAMP的Mg2+浓度优化结果见图3。

图3 基于hlyA的real-time LAMP反应Mg2+浓度的优化Fig.3 Optimization of Mg2+concentration for real-time LAMP based on hlyA

由图 3 可知，当 Mg2+浓度在 4、6、8 mmol/L 时，realtime LAMP反应有扩增，Mg2+浓度在2 mmol/L时反应不能正常进行，随着Mg2+浓度的增加，Ct值变小，且荧光值增强。当Mg2+浓度为6mmol/L时，Ct值最小且荧光值最大，扩增曲线形状也更好。当Mg2+浓度为8 mmol/L时，Ct值增加，荧光值也减小，由此可见Mg2+浓度过低时反应不能正常进行，而浓度过高则抑制LAMP反应，即基于hlyA的real-time LAMP反应的适宜Mg2+浓度为6 mmol/L。

2.1.4 real-time LAMP检测方法的特异性

基于hlyA的real-time LAMP的特异性见图4。

图4 基于hlyA的real-time LAMP方法的特异性Fig.4 Specificity of the hlyA-based real-time LAMP

由图4a可知，建立的real-time LAMP检测方法对目标菌的DNA模板均呈阳性扩增，而12株非目标菌株均无扩增。由图4b可知，该检测方法中单增李斯特菌的特征熔解峰的熔解温度（melting temperature，Tm）为85℃左右。结果表明，以hlyA为靶基因的real-time LAMP方法具有较好的特异性，引物设计可行。

2.1.5 real-time LAMP检测方法的灵敏度结果

以 10倍梯度稀释（7.3×100copies/mL～7.3×107copies/mL）的单增李斯特菌的DNA模板进行real-time LAMP反应，结果如图5。

图5 基于hlyA的real-time LAMP检测方法灵敏度Fig.5 Sensitivity of the real-time LAMP based on hlyA

由图5可知，该方法的检测限为7.3×101copies/mL。

PCR的灵敏度结果如图6所示。

图6 基于hlyA的PCR灵敏度Fig.6 Sensitivity of PCR based on hlyA

由图6可知，经1%琼脂糖凝胶电泳显示，PCR的灵敏度为7.3×103copies/mL。real-time LAMP方法是PCR检测灵敏度的100倍。

2.2 DARQ-LAMP方法的建立

2.2.1 Bst DNA聚合酶的筛选结果

已有研究表明，在反应体系中Bst DNA聚合酶活性会受到荧光剂、淬灭剂的影响，因此Bst DNA聚合酶的选择对DARQ-LAMP的反应体系有很大的影响。Bst DNA聚合酶的筛选见图7。

图7 Bst DNA聚合酶的筛选Fig.7 Screening of Bst DNA polymerases

如图7所示，以hlyA基因进行DARQ-LAMP反应，Bst DNA LF聚合酶几乎无扩增反应，Bst DNA 2.0聚合酶虽然有扩增反应，但是其扩增效率太低，而Bst DNA 3.0聚合酶扩增效率高、扩增曲线好，故选择Bst DNA 3.0聚合酶。

2.2.2 QPD探针浓度优化结果

QPD探针浓度设置为体系的0%、10%、25%、50%、75%、100%，结果见图 8。

图8 QPD探针浓度优化Fig.8 Optimization of QPD concentration

由图8可知，反应在10%、50%的QPD探针浓度下均可扩增，25%的QPD探针浓度下hlyA基因虽有扩增反应，但是扩增效率低。从整体上看，在50%的QPD探针浓度下虽然荧光值很高，但是基因扩增效率偏低，10%的QPD探针浓度下荧光值在2 000 RFU左右，扩增效率较高，因此选择10%的QPD探针浓度。

2.2.3 Mg2+浓度优化结果

DARQ-LAMP反应Mg2+浓度优化见图9。

图9 DARQ-LAMP反应Mg2+浓度优化Fig.9 Optimization of Mg2+concentration in DARQ-LAMP

由图9可知，以hlyA为靶基因建立的单重DARQLAMP反应中，Mg2+浓度为6 mmol/L时，DARQ-LAMP扩增效率最高。因此，DARQ-LAMP反应体系的适宜Mg2+浓度为 6 mmol/L。

2.2.4 DARQ-LAMP特异性的评价结果

DARQ-LAMP反应的特异性见图10。

图10 DARQ-LAMP反应的特异性Fig.10 Specificity of DARQ-LAMP

由图10可知，以hlyA基因建立的DARQ-LAMP方法只对靶标反应，非目标菌株均无扩增，表明所建立的DARQ-LAMP方法具有较好的特异性。

2.2.5 DARQ-LAMP灵敏度的评价结果

对DARQ-LAMP方法进行灵敏度分析，结果见图11。

图11 DARQ-LAMP的灵敏度Fig.11 Sensitivity of DARQ-LAMP

由图11可知，以7.3×100copies/mL～7.3×107copies/mL的10倍梯度稀释的单增李斯特菌DNA模板进行DARQ-LAMP反应，方法的检测限为7.3×101copies/mL。

3 讨论与结论

食源性致病菌一直是引发食品安全事件的重要因素。传统的检测方法虽具有较高的准确性，但需培养及生化实验，耗费时间长且操作较复杂。近年来一些新方法、新技术逐渐被运用，其中LAMP技术因其具有灵敏度高、特异性强、快速、成本低且不依赖精密仪器的特点，已经成为检测困难样品的有效分析方法，广泛应用于食源性疾病的检测。目前已有较多的传统LAMP技术应用于检测中，但因其需要在反应终点开盖对产物进行染色，无法完全做到特异性识别，且容易造成气溶胶污染。本研究建立的real-time LAMP方法对单增李斯特菌进行快速检测，可避免此问题，从而提高特异性。但real-time LAMP技术由于使用的荧光染料易造成假阳性问题，给实际检测造成不便。

因此，本研究在real-time LAMP方法的基础上建立DARQ-LAMP方法，分别在对应一条内引物的5’端修饰荧光基团（或淬灭基团），并加入一条与F1c（或B1c）部分互补且3’端修饰淬灭基团（或荧光基团）的探针。此时荧光基团和淬灭基团距离相近使荧光淬灭，当目的基因存在时，反应扩增，内引物与探针分开，淬灭基团与荧光基团分开，激发荧光基团发光，从而进行快速检测。本方法的适宜反应温度为63℃、Mg2+浓度为6 mmol/L；通过筛选确定Bst 3.0 DNA聚合酶作为扩增酶，其具有扩增效率高和稳定性好的优点；QPD探针浓度为10%，在此浓度下，单增李斯特菌的扩增效率较高，荧光值较大。研究表明，建立的单增李斯特菌DARQ-LAMP检测方法具有较好的特异性和灵敏度，检测限为7.3×101copies/mL，灵敏度是普通PCR的100倍。

在DARQ-LAMP方法的探针帮助下，能快速准确地对致病菌进行检测，本研究的结果证明了DARQLAMP方法的可行性，后续可尝试建立多重DARQLAMP方法，利用分子拉链式循环扩增，将探针与内引物分别标记荧光基团和淬灭基团，杂交形成淬灭探针双链，实现在一个反应管中对多个目的基因的快速、高效检测。未来可将DARQ-LAMP方法应用于更多种类的食源性致病菌检测，建立更多的反应体系从而拓宽其在食源性致病菌检测中的应用范围。以DARQLAMP方法为基础的延伸技术在食品安全监管领域前景广阔。然而，单种检测方法有其局限性，未来可尝试将这种方法与其他方法结合，将不同方法的优势整合。例如与微流控技术、芯片实验室等微型实验室技术相结合，由于其能分隔成多个反应单元，避免了开盖可能形成的气溶胶污染等，同时满足多样本、多菌种同步定性检测及鉴定的需求，实现检测技术的微型化、自动化。未来可研发试剂消耗少、交叉污染风险小以及更适合对较多靶标进行现场快速检测的DARQ-LAMP方法，使其具有更广阔的适用范围和更强的应用潜力，能快速、精准地检测食源性致病菌。