大白菜枯萎病生防木霉菌的筛选及其防治效果

宋雨萌，刘文杰，户喜朝，袁忠林，罗 兰

（青岛农业大学植物医学学院·山东省植物病虫害绿色防控工程研究中心 山东青岛 266109）

大白菜（Brassica rapavar.pekinensis）是我国重要的大众蔬菜，味道鲜美、营养丰富，在我国广泛种植，其栽培面积和产量居世界首位[1-2]。大白菜因其含有各种维生素、矿物质和纤维素，而具有保健作用[3]。然而，大白菜在生产过程中易受植物病原菌的侵染造成严重的产量和经济损失[4-5]，其中，大白菜枯萎病是由镰刀菌侵染引起的维管束病害，因其病原菌种类多且寄主广泛而危害严重，全国各地均有发生，严重时发病率在80%以上，造成植株大量死亡[6-8]，因此对大白菜枯萎病防治技术的研究尤为重要。

目前大白菜枯萎病的防治，以化学杀菌剂防治为主，采用抗耐病品种和田间轮作的农业措施为辅。化学杀菌剂虽然可以有效控制枯萎病的发生，但长期大量应用易造成农药残留、食品安全以及环境安全等问题[9-10]。开发对环境友好和诱导植株产生抗病性的生物防治方法具有广阔的应用前景。其中木霉菌（Trichoderma）广泛分布于土壤和根际生态系统，对环境适应能力强[11]。前人研究发现，木霉菌对黄瓜根结线虫[12]、水稻纹枯病[13]、苦瓜枯萎病[14]、番茄枯萎病[15]和草莓灰霉病[16]具有良好的防治效果，同时还具有促进番茄和黄瓜生长的作用[17-19]。然而未见木霉菌对大白菜枯萎病的防效报道。笔者从山东省青岛市胶州市大白菜田中分离获得木霉菌株，采用离体和盆栽方法测定木霉菌对大白菜枯萎病的拮抗作用与防治效果，以期为该病害的生物防治提供更多优质的菌种资源，为开展绿色防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：大白菜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），编号分别为BCFG1 和BCFG2。木霉菌株的编号分别为2019-1、2020-2、2020-5、2020-6、2020-7、2021-1、2021-2、2021-3 和2021-4，共9 株，分离于大白菜根际。以上菌株由青岛农业大学植物医学学院农药学实验室保存备用。供试药剂：3×108CFU·g-1哈茨木霉可湿性粉剂，为美国拜沃股份有限公司产品。

供试大白菜品种：精品胶白一号，由青岛市胶州市大白菜研究所育成，为中晚熟一代杂种，抗病、丰产、整齐、球形好，风味品质优、口感好、可密植、耐贮运。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15～20 g、蒸馏水1000 mL，用于拮抗木霉菌的筛选。麦粒培养基：麦粒50 g、蒸馏水100 mL 浸泡24 h 后灭菌，用于枯萎病菌和木霉菌孢子的培养。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌对大白菜枯萎病的离体抑菌活性测定 试验于2021 年5-9 月在青岛农业大学植物医学学院农药毒理学实验室进行。采用平板对峙法测定木霉菌对大白菜枯萎病菌的拮抗作用[20]。将直径5 mm 的木霉菌菌饼放置于PDA 平板中距离中心点2.5 cm 的一端，在另一侧距离中心点2.5 cm处放置相同大小的大白菜枯萎病菌菌饼，以无菌空白PDA 菌饼作为对照，3 次重复，放于28 ℃恒温培养7 d 后，采用十字交叉法测量对照组和处理组大白菜枯萎病菌菌落半径并计算抑菌率。

采用平板倒扣法测定木霉菌对大白菜枯萎病菌的熏蒸作用[21]。将直径5 mm 木霉菌菌饼接于PDA 平板中央，另一平板中央接相同大小的大白菜枯萎病菌菌饼，将两平板对扣，木霉平板在下方，封口膜密封。以接种大白菜枯萎菌而不接木霉菌的平板倒扣作空白对照。3 次重复，28 ℃恒温培养5 d 后，采用十字交叉测量各处理的大白菜枯萎病菌菌落直径，计算抑菌率。

1.2.2 拮抗木霉菌株的鉴定 形态学鉴定：将拮抗作用较好的菌株分别接种到PDA 培养基上，28 ℃恒温培养，观察各菌株菌落形态特征。待产生孢子后，在显微镜下观察其形态特征，参照相关文献资料[22]进行分类学鉴定，初步明确病原菌的分类地位。

分子生物学鉴定：分别提取木霉菌株的DNA，采用真菌的通用引物（ITS1 和ITS4）进行PCR 扩增[23]。采用25 μL PCR 反应体系：ddH2O 17.25 μL、10×EasyTaqBuffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA 1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL。反 应 程 序：94 ℃3 min；94 ℃45 s，58 ℃45 s，72 ℃40 s，34 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司测序，以测得序列为索引，在NCBI 数据库中进行Blast 比对分析。选择同源性较高的序列用MEGA 软件的UPGMA 法构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.2.3 拮抗木霉菌对大白菜枯萎病的盆栽防效

采用灌根的盆栽法测定木霉菌发酵液对大白菜枯萎病的防治效果[24]。试验于2021 年8—11 月在光照培养箱中进行，温度（25±1）℃，相对湿度60%～70%，光照周期为16 h 光照/8 h 黑暗。用250 mL锥形瓶麦粒培养基分别培养病原菌BCGF1、BCGF2 和木霉菌株2019-1 和2021-2。待其产孢后，用灭菌水配成孢子悬浮液。采用灌根法按每杯接入10 mL 浓度105CFU·g-1土孢子液（BCGF1 和BCGF2 各5 mL）培育1 d 后，选取大小一致，健康正常的具有2 片真叶的白菜幼苗按1 株/杯移栽至接种致病菌的直径7.0 cm 高度7.5 cm 太空杯中，用孢子浓度为108CFU·mL-1的菌株2019-1 和2021-2 发酵液按每杯10 mL 灌根，以微生物杀菌剂哈茨木霉WP200 倍液为药剂对照，同时设不接枯萎病菌和只接枯萎病菌为阴性对照和阳性对照。太空杯均放入长45 cm、宽30 cm 的塑料托盘中，每处理10 株，3 次重复，随机区组排列。常规管理，20 d 后调查各处理白菜幼苗的株高、根长和鲜质量及发病情况并计算病情指数和防治效果[25-26]。

1.3 数据分析

抑菌率/%=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100。

病情指数=Σ（各级病株数×相对级数值）/（调查总株数×最高病级）×100。

防治效果/%=[（空白对照病情指数-处理病情指数）/空白对照病情指数]×100。

试验数据采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，采用Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 木霉菌对大白菜枯萎病的离体抑菌活性

供试的9 株木霉菌对2 株大白菜枯萎病菌均有一定抑制作用（表1）。9 株木霉菌对大白菜枯萎病菌BCGF1 和BCGF2 的抑制率分别在51.49%～81.42%和41.54%～87.18%，其中以菌株2021-2 和2019-1 的拮抗作用较强（图1）。9 株木霉菌对大白菜枯萎病菌BCGF1 和BCGF2 的熏蒸抑制率分别在5.98%～22.97%和9.16%～21.91%，以菌株2020-6和2021-1 的熏蒸作用最强（图2）。

图1 木霉菌对大白菜枯萎病菌的抑制效果（7 d）

图2 木霉菌对大白菜枯萎病菌的熏蒸效果（5 d）

表1 木霉菌对大白菜枯萎病菌的离体抑菌活性 %

2.2 拮抗木霉菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 由图3 可以看出，菌株2019-1菌落由白色至浅黄色至绿色，平铺在培养基上，呈同心轮纹状排列，具有清新的芳香气味。分生孢子梗垂直对生或互生，分生孢子绿色、近球形、大小3.2～4.5 μm（n=20）；菌株2021-2 菌落黄绿色，菌丝不太丰富，平铺在培养基上，孢子粉很多呈球状。分生孢子梗分支不规则，单生或对生，较少单生，呈帚状瓶颈形，浅绿色至绿色，分生孢子椭圆形，大小

图3 菌株2019-1 和2021-2 的菌落形态、分生孢子梗和分生孢子特征

2.5～4.0 μm（n=20）。

2.2.2 分子鉴定 以ITS1、ITS4 为引物对菌株2019-1 和2021-2 的基因组ITS 区段序列进行PCR扩增，测序结果显示其扩增片段分别为610 bp 和646 bp。经Blast 比对分析，发现属于木霉属（Trichoderma）。构建的系统发育树显示（图4），菌株2019-1 与深绿木霉（Trichoderma atroviride）位于同一进化分支；菌株2021-2 与哈茨木霉（T. harzianum）位于同一进化分支。

图4 木霉菌株的系统发育树

2.3 拮抗木霉菌对大白菜枯萎病的盆栽防效

盆栽试验结果表明（表2），木霉菌发酵液采用灌根处理20 d 后，菌株2019-1、2021-2 和对照药剂哈茨木霉处理的白菜苗明显比枯萎病菌对照处理的白菜幼苗发病轻，其病情指数分别为31.67%、33.96%和32.56%，均显著低于只接种病原菌的对照处理，防治效果分别为67.24%、64.87%和66.32%，菌株2019-1 和菌株2021-2 的病情指数差异不显著，且与对照药剂哈茨木霉的病情指数差异不显著，三者均与接菌对照差异显著。由此表明，上述2株木霉菌对大白菜枯萎病具有较好的防治效果。另外，经木霉发酵液处理的白菜幼苗的鲜质量、株高和根长显著大于接种枯萎病菌的白菜幼苗，菌株2019-1、2021-2 和哈茨木霉处理的白菜幼苗的鲜质量、株高和根长差异不显著，但均与接菌对照和空白清水对照差异显著，以空白清水处理的幼苗生长最好，其次为菌株2019-1、2021-2 和哈茨木霉，接菌对照幼苗生长最差，表明菌株2019 和2021-2 及哈茨木霉对白菜生长有一定的促生作用。

表2 木霉菌对大白菜枯萎病的盆栽防治效果

3 讨论与结论

木霉菌是一种重要的生防菌，大量的研究结果表明，其对多种植物病害具有良好的防治效果和促生作用[12-19]。鲁海菊等[28]试验表明，内生木霉菌对枇杷根腐病的防效在80%以上；赵玳琳等[29]发现微生物菌剂与木霉菌混合使用对甘蓝黑腐病的防效可达79.16%，且具有促生作用。Cong 等[30]发现拟康氏木霉（T.pseudokoningii）与黑根霉（Rhizopus nigricans)混合发酵液对黄瓜枯萎病的田间防效达76.5%。卢德鹏等[31]试验表明，木霉菌可湿性粉剂对番茄枯萎病防效在70%以上，与对照药剂防效相当，且具有促生作用。陈凯等[32]筛选到2 株木霉菌对黄瓜枯萎病田间防效为64.19%～66.89%，而混合使用防治效果可提高到73.65%。虽然木霉菌对其他植物病害防治效果的研究较多，但目前未见其防控大白菜枯萎病的相关报道。

近年来，由于栽培方式的改变，大白菜枯萎病发生严重，对其产量造成巨大的威胁[8]。化学防治是大白菜枯萎病的主要防治手段，但已出现污染环境等问题，绿色防控在未来显得尤为重要[8，27]。笔者的研究从大白菜根际分离木霉菌株，以枯萎病菌为靶标菌，筛选到对大白菜枯萎病菌具有良好拮抗作用的深绿木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2，其抑菌率均为70%以上，熏蒸抑制率10%左右，盆栽防效为64.87%～67.24%。因此，开发深绿木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2 生防制剂防治大白菜枯萎病具有广阔的应用前景。

综上所述，深绿木霉2019-1 和哈茨木霉2021-2对大白菜枯萎病菌的抑菌活性较高，可有效防治大白菜枯萎病，促进植物生长，有较好的应用潜力。木霉菌的防病促生机制是多方面的，是生防菌推广应用的基础。下一步需要深入研究2019-1 和2021-2 菌株的抑菌物质、作用机制和加工工艺，并进一步探究其高效利用技术，为大白菜枯萎病的绿色防控提供重要的理论和技术支撑。