砧用中国南瓜种子萌发期耐盐性鉴定评价

张 蒙，周经明，马 玮，疏 琴，段 颖，王长林，3

（1.中国农业科学院蔬菜花卉研究所·蔬菜生物育种全国重点实验室 北京 100081； 2.岳阳市农业科学研究院湖南岳阳 414000； 3.中蔬生物科技（寿光）有限公司 山东寿光 262700）

土壤盐渍化是制约蔬菜作物生产的重要因素之一，设施栽培环境下，由于连作引起土壤离子失衡，造成盐害和渗透胁迫，严重威胁设施栽培蔬菜的品质和产量[1-2]。利用砧木能有效改善植株的抗逆性和抗病性，从而提高设施蔬菜生产效率和经济效益[3-5]。中国南瓜（Cucurbita moschataDuch.）是葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属一年生蔓生草本植物，原产于中美洲地区，在世界范围内广泛栽培。中国南瓜根系发达，是黄瓜、西瓜、甜瓜等瓜类蔬菜嫁接生产中的常用砧木。前人研究表明，选用耐盐性强的砧用中国南瓜品种，能抑制黄瓜幼苗植株Na+浓度、提高叶片光合作用和抗氧化能力，从而降低盐胁迫对产量的影响[6-8]。因此，选育抗盐性强的砧用中国南瓜品种，对提高葫芦科蔬菜的产量和品质具有重要意义。

建立高效而准确的鉴定评价体系是筛选耐盐性种质资源、培育耐盐新品种的前提[9-12]。目前，关于砧用中国南瓜耐盐性筛选及机制研究主要集中于幼苗生长阶段，而对萌发期阶段的研究报道较少[13-15]。采用营养液水培法研究NaCl 对植株生长的影响，发现随着NaCl 浓度的增加，中国南瓜幼苗植株生长呈现明显的衰弱趋势，叶绿素含量、气孔导度、净光合速率等光合参数表现出先升高后降低的趋势。当NaCl 浓度高于100 mmol·L-1时，中国南瓜存活率受到显著抑制[16]。此外，在高浓度NaCl胁迫下，幼苗的盐害指数、脯氨酸含量、可溶性糖含量、电解质渗透率等指标也受到显著影响，这些指标可用于幼苗期耐盐性评价[10，17-18]。

与幼苗期相比，种子萌发阶段是植株最先感知土壤盐胁迫的阶段，也是评价植物耐盐性的重要时期之一[19-20]。在种子萌发期进行种质耐盐性筛选，还具有高通量、鉴定周期短、容易操作等优点[21]。目前砧用中国南瓜萌发期的鉴定评价以耐寒性、耐热性为主，在耐盐性鉴定评价研究方面，王清华等[22]以3 个品种砧木南瓜种子为试材，发现盐胁迫对萌发时期的主根长度、侧根数、下胚轴长度及平均鲜质量等指标的影响较为显著。孙涌栋等[23]对22 份南瓜属杂交种进行耐盐性研究，认为隶属函数法可以避免单一指标的片面性，从而较为全面地评价南瓜的耐盐性。尽管隶属函数分析法经常应用于中国南瓜种质的鉴定评价，但对于砧木耐盐性的鉴定评价等相关报道尚不多见，一定程度上限制了砧用南瓜种质耐盐性种质资源的挖掘和利用[23-24]。

笔者以65 份砧用中国南瓜种质为试验材料，研究了盐胁迫对种子萌发率、发芽指数、发芽势、初生根长度、下胚轴长度等指标的影响，并利用相关性分析、隶属函数分析和主成分分析对砧用中国南瓜耐盐性进行综合评价，建立砧用中国南瓜种子萌发期耐盐性的鉴定评价体系，以期为砧用中国南瓜种质创新和品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

65 份中国南瓜种质来源于4 个国家及中国13个省（直辖市），由中国农业科学院蔬菜花卉研究所南瓜育种课题组收集、保存和纯化，除火凤凰（Cmo12）为商业品种外，其他均为6 代以上纯合自交系，编号为Cmo01～Cmo65，各种质名称及来源地见表1。

1.2 试验设计

试验于2019 年6—8 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地进行。种子萌发试验在一次性无菌培养皿中进行。萌发滤纸、ddH2O、不同浓度的NaCl 溶液均在121 ℃条件下进行高压灭菌15 min。选取籽粒饱满的种子，55 ℃温汤浸种20 min 后，30 ℃温水浸种5 h，然后在超净工作台上将种子浸泡于75%乙醇进行表面消毒30 s，再用6.5%NaClO 消毒液（含有0.5%Triton）振荡消毒15 min，用灭过菌的ddH2O 冲洗5～6 遍。向培养皿中放入一张灭菌滤纸，以ddH2O 为对照，加入NaCl溶液5 mL，将种子用镊子摆放于培养皿内，封口膜密封，在28 ℃催芽箱中按照随机区组排列放置，湿度保持为80%。每个培养皿中放10 粒种子，每处理3 次重复。种子萌发2 d 后，每日统计各处理种子出芽情况，并测定各生长指标。

盐胁迫浓度筛选：以5 份中国南瓜高代自交系方城白皮窝瓜（N1）、5Bb040（N2）、5Bb738（N3）、龙洲南瓜（N4）、古县长南瓜（N5）为试材，以ddH2O 为对照，60、120、180、240、300 mmol·L-1NaCl 溶液为处理组进行萌发试验。萌发第7 天测定种子的萌发率和初生根长度，试验设3 次重复。

耐盐性鉴定：以65 份砧用中国南瓜种质为试材，以ddH2O 处理为对照组，120 mmol·L-1NaCl 溶液为盐胁迫梯度。每个培养皿中放置10 粒种子，每份种质播种3 个培养皿。种子萌发2～7 d 后，对各项生长指标进行测定，试验设2 次重复。

1.3 生长指标测定方法

萌发以种孔开裂、胚根伸长至种子长度的一半为发芽标准进行计数。催芽后3～7 d，每隔24 h 记录1 次种子发芽数，共记录5 次。第7 天测定初生根长度和下胚轴长度。种子萌发率和发芽指数参照孙洪助等[11]测定方法，并根据第3～5 天的萌发数计算发芽势。初生根长度和下胚轴长度均用游标卡尺测定（mm），每处理测定10 株。生长指标计算公式如下：

其中Gt表示种子发芽第t（d）当日萌发率，Dt表示发芽天数。

1.4 数据统计与分析

数据统计与分析参照[25]的方法进行，原始数据采用SPSS 22.0 对数据进行方差分析，并运用Duncan’s 检验法进行显著性分析，采用Python 3.7 进行相关性分析、主成分分析及隶属函数分析。首先计算各生长指标的盐胁迫耐受系数α，计算公式为：

盐胁迫耐受系数α=处理组测定值/对照组测定值。 （6）

对各种质不同性状的盐胁迫耐受系数进行标准化和均一化处理，获得0.0～1.0 之间的赋值。采用皮尔逊相关系数对盐胁迫耐受系数α进行相关性分析，采用主成分分析法进行主因子分析。

隶属函数分析中采用的公式如下：

Xj表示根据主成分分析所计算的综合指标值；Xmax和Xmin分别表示各种质在该综合指标计算值中的最大值和最小值。

权重计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫处理浓度的确定

以5 份中国南瓜高代自交系N1～N5 为试材，种子萌发7 d 后分别统计不同NaCl 浓度处理下的相对萌发率和相对下胚轴长度。图1-A 显示了不同种质在盐胁迫下的耐盐性差异。由图1-B～C 可知，与对照组相比，5 份种质的萌发率和下胚轴长度均受到不同程度的抑制。120 mmol·L-1NaCl 处理时，各种质相对萌发率为21%～100%，相对下胚轴长度为17%～46%，不同种质之间的耐盐性差异较大（图1-B～C）；而180 mmol·L-1NaCl 处理时，5 份种质的相对萌发率为7%～100%，相对下胚轴长度仅为9%～16%；240 mmol·L-1NaCl 处理时，仅有1份种质（N2）表现为耐盐性较强，萌发率为87%，其他4 份种质萌发率均低于23%。由此可见，当NaCl处理浓度高于180 mmol·L-1时，种质之间表型差异不明显，因此选择120 mmol·L-1NaCl 进行砧用中国南瓜萌发期耐盐性鉴定。

图1 中国南瓜种质耐盐性筛选NaCl 浓度的确定

2.2 盐胁迫耐受系数变异幅度及相关性分析

以65 份中国南瓜种质为供试种质，分别用ddH2O 和120 mmol·L-1NaCl 进行萌发试验，计算各生长指标的盐胁迫耐受系数（α）。5 项生长指标盐胁迫耐受系数的平均值介于0.28～0.83 之间，变异系数介于0.23～0.64 之间，离散程度较高，说明选择120 mmol·L-1NaCl 处理能使不同供试种质表现出较为明显的耐盐性差异。由表2 可知，中国南瓜种子萌发率的盐胁迫耐受系数（α）最大值为1.00，最小值为0.33，平均值为0.83，表明中国南瓜种质在萌发初始阶段对盐胁迫表现出较大的差异。Cmo38（德丰C06）的发芽指数（α发芽指数=1.37）和Cmo12（火凤凰）的发芽势（α发芽势=1.20）均超过1.00，说明NaCl 处理在一定程度上促进了胚根突破种皮的萌发。初生根长和下胚轴长的盐胁迫耐受系数分别在0.09～0.97 和0.05～0.80 之间，表明盐胁迫也影响了萌发后初生根的生长。其中，Cmo65（黄狼）和Cmo10（火凤凰B）初生根长度的盐胁迫耐受系数分别为0.97 和0.93，说明这2 份种质在萌发后初生根伸长期表现出较强的耐盐性。

表2 盐胁迫对中国南瓜种质各项生长指标的影响

对各生长指标的盐胁迫耐受系数α进行相关性分析显示（表3），萌发率与发芽势相关性达到0.80，与发芽指数、初生根长的相关性也分别达到0.57 和0.49，呈极显著相关。如果仅仅选择单一或其中1～2 个生长指标对中国南瓜种质进行耐盐性鉴定，可能会对同一份种质存在不同的鉴定评价结果。因此，需要进一步挖掘各生长指标的内在联系，建立较为全面的评价方法。

表3 中国南瓜各单项生长指标的盐胁迫耐受系数（α）相关性分析

2.3 主成分分析

利用主成分分析对各生长指标的盐胁迫耐受系数进行降维，将原始指标信息转变为3 个综合因子，累计方差贡献率达到87.05%，表明这3 个综合因子可代表原始指标的大部分信息（表4）。其中第1 主成分以萌发率和发芽势为主，贡献值分别为0.504 和0.498，发芽指数的贡献值也较高。第2 主成分以初生根长度和下胚轴长度为主，贡献值分别为-0.468 和-0.709，第3 主成分仍以初生根长度和下胚轴长度为主，其方差贡献率较小。主成分分析表明，种子萌发初始阶段相关的生长指标（萌发率、发芽指数、发芽势）与种子萌发后期相关的生长指标（初生根长度、下胚轴长度）均表现出较高的贡献率，共同决定了种质的耐盐性。

表4 主成分分析各综合指标及因子贡献率

2.4 隶属函数分析

根据主成分分析的贡献率计算各种质生长指标盐胁迫耐受系数的隶属函数值和综合评价值D（表5）。65 份种质耐盐性综合评价值D介于0.77～0.13 之间，根据D值将种质耐盐性划分为4 类。第1 类群共7 个种质，D值介于0.63～0.77，分别为Cmo37（0.77）、Cmo33（0.72）、Cmo14（0.72）、Cmo23（0.64）、Cmo10（0.63）、Cmo47（0.63）、Cmo45（0.63），该类群种质在种子萌发初期和萌发后生长期均表现出较强的抗性，可作为耐盐性砧用南瓜品种选育的亲本资源；第2 类群共27 个种质，D值0.46～0.61，表现为中等耐盐性；第3 类群共25 个种质，D值0.30～0.45，表现为中等盐敏感性；第4 类群共6个种质，D值为0.13～0.29，分别为Cmo32（0.29）、Cmo34（0.29）、Cmo60（0.27）、Cmo57（0.26）、Cmo39（0.25）和Cmo29（0.13），表现为较强的盐敏感性，不适宜作为耐盐性砧木品种选育的候选种质。

表5 中国南瓜种质耐盐性隶属函数值

续表5

3 讨论与结论

3.1 砧用中国南瓜萌发期耐盐性综合评价体系的建立与优化

种子萌发过程可分为2 个相对独立的阶段，第1 阶段为种子吸胀萌动、胚根突破种皮，第2 阶段为胚根、下胚轴伸长以及地上部生物量的积累[26-27]。发芽率、发芽势、发芽指数、初生根和下胚轴长度是评价种子萌发的重要指标，反映了种子发芽的速度、整齐度和幼苗健壮程度[14]。前人研究表明，盐胁迫下中国南瓜种质各生长指标之间存在一定的相关性，这些指标能够从不同的角度反映出耐盐性的强弱，但是仅凭单一指标所反映的耐盐性，往往不能代表种质在整个萌发过程中的耐盐性，难以同时对多份种质的耐盐性强弱开展较为客观的评价[20，22]。也有一些研究采用了综合评价方法，但限于砧木种质多样性不够丰富等客观情况，难以从中选择典型的耐盐性种质[23]。

笔者的研究选用了65 份砧用中国南瓜高代自交系材料，种质遗传多样性较为丰富，通过计算盐胁迫耐受系数，消除了不同遗传背景种质之间存在的生长差异。相关性分析和主成分分析显示，种子的耐盐性由萌发初期和初生根伸长期2 个过程共同决定，主成分分析显示3 个综合因子代表5 个原始指标约87%的信息，通过对降维后的综合因子进行解析，发现萌发初期（3～5 d）和萌发后期（5～7 d）2个阶段的生长指标都表现出较高的贡献率，进一步说明了采用综合评价法的科学性和必要性，也确保了种质耐盐性评价的客观性，这种综合评价方法目前也广泛应用于黄瓜等其他葫芦科蔬菜的耐盐性鉴定评价中[28-29]。

值得注意的是，由于设施栽培环境下的土壤盐渍化是非常复杂的复合胁迫[30-32]，而笔者的综合评价体系建立在NaCl 单一处理条件下，因此筛选获得的耐盐性种质还需进行田间评价，同时应考虑继续优化和完善中国南瓜砧木在复合因子胁迫下的耐受性综合评价体系，从而提高该评价体系在田间实践中的应用意义。

3.2 耐盐性种质资源的筛选与利用

我国南瓜种质资源丰富，但目前砧用南瓜优良品种相对匮乏[33-36]。笔者在研究中采用的65 份种质，来源地较为广泛，种质遗传多样性较高。根据隶属函数分析计算各种质耐盐性的综合评价值D进行排序，共获得7 份耐盐性强的种质和6 份耐盐性弱的种质。7 份耐盐性强的种质中，火凤凰B、砧木4-2、白籽南瓜I-5、砧木18-4 等均为从常见砧木品种中分离出来的高代自交系，而德丰C05、商县小北瓜-2、商县小北瓜-3 均为新创制的种质，具有较高的砧木育种应用价值。前人研究指出，中国南瓜种质耐盐性在萌发期和幼苗期的表现并不一致，这可能是由萌发期和苗期不同的耐盐机制引起的[37]。因此，后续研究将继续围绕苗期耐盐性、抗病性、去蜡粉能力等一系列砧木性状，进一步筛选表现优良的砧用种质，评价其耐盐性砧木品种的育种潜力。

关于植物耐盐性调控机制已经在拟南芥、水稻等模式植物中研究得较为明确。拟南芥初生根耐盐性与根尖氧化还原信号途径密切相关[38-40]。在中国南瓜砧木中的研究也进一步揭示了活性氧对黄瓜嫁接苗耐盐性的调控作用。前人研究发现，H2O2信号参与调控嫁接苗根尖Na+、K+转运及向地上部运输，并通过介导气孔运动降低蒸腾速率，从而使细胞中的的离子浓度、碳水化合物代谢有关的重要分子信号等维持在一定水平，避免嫁接苗受到盐胁迫的影响[40]。在盐胁迫下，施加外源H2S 可以通过活性氧清除机制提高南瓜幼苗抗氧化酶SOD 和CAT 酶活力，并提高脯氨酸含量以缓解渗透胁迫，从而保护幼苗膜质稳定性[41]。遗传分析结果表明，南瓜耐盐性是受到多个基因共同控制的复杂性状，然而目前，尚未在南瓜中通过图位克隆的方式鉴定出参与耐盐性状形成的主效基因[42]。笔者的研究通过综合评价体系筛选获得一批耐盐性差异显著并且遗传背景较为清晰的砧木种质资源，后续将继续利用这些种质进行遗传群体构建，解析中国南瓜耐盐性遗传规律，并对重要QTL 或基因调控位点进行定位并开发分子标记，以期提高耐盐性砧木的品种选育效率，为解决设施栽培瓜菜作物土壤盐碱化问题提供一定的理论依据。