四种技术平台检测甲状腺癌NTRK融合变异的比较

陈灵锋,林 洁,俞训彬,吴义娟,游治杰,陈小岩

神经营养因子受体酪氨酸激酶(neurotrophic receptor tyrosine kinase, NTRK)基因家族包括NTRK1、NTRK2和NTRK3,NTRK融合变异是许多罕见肿瘤的驱动因素,例如婴儿纤维肉瘤、先天性中胚层肾瘤以及乳腺和唾液腺分泌性癌等[1]。拉罗替尼和恩曲替尼已相继在中国获批用于治疗NTRK融合阳性的包括甲状腺癌在内的实体瘤。有别于单核苷酸变异或小片段插入缺失等突变类型的检测,融合基因检测更为复杂,可针对融合基因的DNA、RNA和蛋白等不同水平进行检测。常见的NTRK融合变异检测方法包括:FISH、免疫组化、二代测序(next generation sequencing, NGS)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR)。本研究对40例同一组临床样本同时行FISH、免疫组化、DNA-based NGS和qRT-PCR法检测NTRK融合变异,比较四种方法的一致性,分析各方法的敏感性、特异性和优、缺点。

1 材料与方法

1.1 样本选择检索2018～2022年福建省立医院病理科数据库,对行免疫组化检测pan-TRK蛋白的病例进行回顾性审查,将20例免疫组化NTRK阳性标本(包括11例甲状腺癌,2例脂肪纤维瘤病样神经肿瘤,2例涎腺分泌性癌,1例去分化脂肪肉瘤,1例隆突性皮肤纤维肉瘤,3例右鼻腔脑膜源性肿瘤)作为临床研究样本,同时行FISH、DNA-based NGS和qRT-PCR法检测NTRK融合;并选择20例免疫组化NTRK阴性且qRT-PCR检测BRAF V600E突变阳性的甲状腺癌标本作为NTRK融合阴性对照样本(研究表明NTRK融合与BRAF等驱动基因热点突变互斥[2]),所有样本均为福尔马林固定石蜡包埋组织。

1.2 仪器与试剂主要实验仪器为Illumina NextSeq 500,安捷伦科技公司的荧光定量PCR仪(Mx3000P),全自动免疫组化染色仪(VENTANA)。人类肿瘤多基因突变联合检测试剂(可逆末端终止测序法)、人类NTRK基因融合检测试剂(荧光PCR法)试剂均由厦门艾德公司提供;NTRK1/2/3 Dual Color Break Apart Probe探针由广州安必平公司提供;VENTANA pan-TRK(EPR17341)Assay由上海罗氏公司提供。

1.3 免疫组化pan-TRK(EPR17341)抗体在全自动免疫组化染色仪(VENTANA)上染色,根据试剂盒说明书进行判读:以阑尾组织作为外对照,神经和神经节细胞弱至强染色;黏膜、平滑肌和淋巴样聚集体无染色;血管壁作为内对照;组织中任何染色超过背景染色强度,且阳性细胞≥1%即判为阳性,不同类型的细胞染色模式都判读为阳性(细胞质、细胞膜、细胞核、外周核)。弥漫强阳性的标准为:≥75%的肿瘤细胞强阳性,呈黄色或褐色颗粒状,信号定位准确。

1.4 FISH每个样本均执行3次NTRK1/2/3检测,根据试剂盒说明操作,阳性阈值设为15%的细胞呈异常信号[3]。

1.5 DNA-based NGS根据试剂盒说明书操作,探针覆盖的NTRK检测区域:NTRK1(外显子8/9/10/13,内含子8/9)、NTRK2(外显子12/13/15/16,内含子12/15)、NTRK3(外显子3/5/7/9/11/13/15/17/18)以及ETV6基因(外显子4/5/6,内含子4/5)。

1.6 qRT-PCR40例样本提取的RNA内控HEX信号Ct值均<20,RNA质量均符合质控要求,根据试剂盒说明书操作,试剂盒涵盖了109种融合类型:NTRK1的63种融合类型(LMNA:exon10-NTRK1:exon11、TPM3:exon7-NTRK1:exon10等),NTRK2的24种融合类型(VCL:exon16-NTRK2:exon12、ETV6:exon5-NTRK2:exon15等),NTRK3的22种融合类型(ETV6:exon5-NTRK3:exon15、EML4:exon2-NTRK3:exon14等)。

1.7 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。运用Kappa检验进行两种检测方法结果的一致性分析,Kappa≥0.75为一致性较好,0.4

2 结果

2.1 FISH检测FISH检测显示,40例样本中13例阳性,其中甲状腺癌9例,涎腺分泌性癌2例,脂肪纤维瘤病样神经肿瘤2例。阳性样本的信号如下:红绿分离(NTRK1,n=1;NTRK3,n=10)和单一绿色(NTRK1,n=2,均为脂肪纤维瘤病样神经肿瘤)(图1)。

图1 FISH检测NTRK融合阳性:A. NTRK3重排阳性(红绿分离信号模式);B. NTRK1重排阳性(单一绿色信号模式) 图2 免疫组化检测NTRK融合阳性,VENTANA染色:A. 细胞核和细胞质中pan-TRK呈弥漫强阳性;B. 细胞核中pan-TRK呈弥漫强阳性;C. 细胞膜中pan-TRK呈弥漫强阳性;D. 细胞质中pan-TRK呈弥漫中等阳性

2.2 免疫组化、DNA-based NGS和qRT-PCR检测与FISH检测比较在20例免疫组化NTRK阴性的甲状腺癌标本中,DNA-based NGS、qRT-PCR与FISH检测均为阴性;在20例免疫组化阳性样本中,12例为细胞核和细胞质弥漫强阳性(甲状腺癌9例,脂肪纤维瘤病样神经肿瘤2例,去分化脂肪肉瘤1例)(图2),2例细胞核弥漫强阳性(均为涎腺分泌性癌),1例细胞膜弥漫强阳性(甲状腺癌),1例细胞核和细胞质弥漫中等阳性(隆突性皮肤纤维肉瘤),4例细胞质弥漫中等阳性(甲状腺癌1例,右鼻腔脑膜源性肿瘤3例)(表1)。与FISH检测相比,免疫组化的敏感性、特异性、阳性预测值(positive predictive value, PPV)、阴性预测值(negative predictive value, NPV)、总符合率(total coincidence rate, TCR)和Kappa值详见表2,免疫组化的PPV较差(65.0%),与FISH检测结果的一致性一般(Kappa<0.75);但免疫组化弥漫强阳性的PPV为86.7%(13/15),提示免疫组化检测的PPV随着染色强度增加而增加。其中,在免疫组化与FISH均检测的31例甲状腺癌样本中,免疫组化的PPV也较差(81.8%,9/11)。

表1 四种方法检测NTRK融合结果

表2 四种方法检测NTRK融合的结果比较

40例样本中,DNA-based NGS检测NTRK融合阳性8例(图3),DNA-based NGS与FISH检测结果的一致性一般(Kappa<0.75,表2),其敏感性较差(61.5%,8/13)。其中,在DNA-based NGS与FISH均检测的31例甲状腺癌样本中,敏感性也较差(44.4%,4/9)。

图3 qRT-PCR和DNA-based NGS检测NTRK融合阳性:A. NTRK3基因融合阳性(箭头),qRT-PCR法;B. LMNA-NTRK1融合阳性(箭头所指融合断点信号),DNA-based NGS法;C. ETV6-NTRK3融合阳性(箭头所指融合断点信号),DNA-based NGS法

qRT-PCR法检测NTRK融合12例阳性,与FISH检测结果的一致性较好(Kappa=0.942),仅1例样本(脂肪纤维瘤病样神经肿瘤)检测结果不一致。其中,在qRT-PCR与FISH技术均得到检测结果的31例甲状腺癌样本中一致性为100%(31/31)。

3 讨论

FISH技术是一种基于DNA的检测方法,具有良好的敏感性和特异性,常被用作评估是否存在基因重排的标准方法[4-5],因此本研究选择FISH法作为参照方法。FISH检测的阳性信号有红绿分离或单一绿色的模式,其中单一绿色的信号模式大部分是NTRK发生非经典的融合类型[6]。NTRK重排可通过平衡、不平衡易位或大片段缺失等形式和任何伙伴基因发生有效或无效的融合,FISH检测无法排除这种无效的融合,此外复杂的重排模式以及结果判读均可影响FISH结果的解释[7]。

甲状腺癌NTRK融合的发生率为1%～6%[8-9]。有研究显示,采用免疫组化结合BRAF V600E突变检测可以作为甲状腺癌NTRK融合阳性的初筛方法[10]。姜阳阳等[11]采用免疫组化和DNA-based NGS检测NTRK,也发现免疫组化可作为甲状腺乳头状癌NTRK融合变异的筛选方法,并且可通过提高免疫组化染色阳性阈值或结合BRAF V600E突变检测进一步增强其准确性。最新研究显示,免疫组化的敏感性和特异性有限,假阴性结果会使患者错失靶向治疗的机会,应考虑对甲状腺癌采取其他检测[12]。

DNA-based NGS的敏感性中等,特异性高,可检测具体融合伴侣基因;RNA-based NGS的敏感性高,特异性高[15]。有研究认为DNA-based NGS在检测NTRK融合方面是合适的,其总体敏感性为81.1%,但当融合涉及分析未涵盖的断点时,会出现假阴性[1]。也有研究认为DNA-based NGS漏检率很高,如Fu等[6]针对18例样本同时行DNA-based和RNA-based NGS检测,DNA水平的漏检率高达76.9%(10/13)。本组32例DNA-based NGS阴性样本中,有5例经FISH和qRT-PCR重新检测证实为阳性,推测NTRK基因断裂点可能在试剂盒探针覆盖的区域之外。并不是所有的DNA-based NGS平台都能识别出所有NTRK基因融合变异,需在融合断点高发的基因内含子区域设计探针,而内含子重复序列多,且融合点多变,但NGS为检测NTRK融合提供了一种精确的方法,能够检测出具体的融合伴侣基因,这是FISH和qRT-PCR技术无法实现的。NGS对人员的要求较高,普通实验室常难以满足,且穿刺活检等小标本检测失败率较高,限制了其应用[16]。

qRT-PCR技术是基于样本RNA进行检测,对标本的要求较高,福尔马林固定石蜡包埋样本提取的RNA质量好坏(主要受组织前处理影响)直接影响实验结果,本组40例样本RNA质量均符合质控要求。与基于DNA水平的技术相比,基于RNA水平的技术更易检出融合基因[1],且只有在RNA水平的融合检出才是该融合能够在功能上被转录和翻译的直接证据[6]。与FISH技术相比,qRT-PCR操作更加简便、结果判读更直观,既缩短了检测周期,又减少了主观因素对结果的影响。融合基因在RNA水平已剪切去除内含子,因此与DNA-based NGS技术相比,qRT-PCR简化了探针设计需充分覆盖的技术要求,避免了由于内含子序列长、断点不固定、重复序列等导致的探针难以捕获的问题。本组排除1例因qRT-PCR检测范围未覆盖的NTRK少见融合类型(LMNA:exon4-NTRK1:exon10)而未检出的样本,qRT-PCR和FISH技术的一致性可达100%(39/39),进一步说明基于RNA检测融合的qRT-PCR技术具有高敏感性、高特异性的优势。然而,qRT-PCR方法也存在不足之处,qRT-PCR检测是一种定制化设计,可检测已知的融合位点,对于引物和探针未覆盖的融合位点和新的融合位点无法检出,该缺陷可以通过更全面的RNA-based NGS或全转录组测序来弥补,但这两种方法检测如前述讨论,可及性较差等特点限制了临床的广泛开展。《中国实体瘤NTRK融合基因临床诊疗专家共识》也推荐qRT-PCR检测可以作为NTRK融合基因发生率高的肿瘤和已知伴侣基因情况下的确诊手段,而甲状腺癌中主要的融合类型为ETV6-NTRK3和TPM3-NTRK1。综上所述,基于RNA的普通qRT-PCR技术可能是适用于病理科常规临床检测甲状腺癌NTRK融合变异的优选方案。

本研究也存在一定的局限性:(1)本研究受条件限制,并未对7例免疫组化阳性而其他3种方法均阴性的标本采用RNA-based NGS进行确认;(2)由于是单中心研究,样本量相对有限,阳性病例主要集中在NTRK1/3融合,对于NTRK2融合检测有待进一步补充;(3)NTRK融合在不同瘤种间差异较大,本研究同一样本4种方法同时检测的主要是甲状腺癌,其他瘤种的比较还有待进一步研究。