植入前遗传学检测后冻融胚胎移植周期妊娠结局的影响因素

胡瑞，魏才娟，贾冬玲，毛斌，马晓玲，杨媛

植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）是通过侵入性胚胎活检，挑选正常胚胎植入子宫的过程，该技术在一定程度上预防了反复妊娠丢失、出生缺陷及遗传性疾病[1]。根据检测方法和目的不同，PGT可分为单基因疾病检测（PGT for monogenic，PGT-M）、染色体重排检测（PGT for structural rearrangements，PGT-SR）和非整倍体筛查检测（PGT for aneuploidies，PGT-A）[2]。经PGT后的可移植胚胎（无遗传突变、染色体结构正常和整倍体）尽可能地减少了因胚胎因素导致的不孕及不良妊娠[3]，所以，临床上针对PGT后患者选择高效、经济及便捷的子宫内膜准备方案是临床治疗的关键。目前，冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）时常用的子宫内膜准备方案包括自然周期（natural cycle，NC）方案、激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）方案、促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa）联合HRT方案。对于较为珍贵的PGT胚胎而言，目前尚无推荐的子宫内膜准备方案。本研究回顾性分析在兰州大学第一医院（我院）生殖医学中心行PGT患者的相关资料及妊娠结局，旨在为PGT患者FET时选取适当的治疗方案提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾性分析2017年1月—2022年1月在我院生殖医学中心行PGT助孕的患者195例、共219个FET移植周期的临床资料。按照子宫内膜准备方案分为NC组（56个周期）、GnRHa+HRT组（102个周期）和HRT组（61个周期）。本研究经我院伦理委员会批准，且所有患者均签署了知情同意书。

1.2 纳入标准及排除标准

1.2.1 纳入标准 PGT-A：①女方年龄＞38岁；②不明原因的反复自然流产（2次及以上）；③不明原因反复种植失败（移植3次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4～6个或高评分囊胚数3个及以上均失败）；④严重畸形精子症。

PGT-M/SR：①夫妇任一方或双方经外周血染色体核型分析诊断为染色体结构异常（相互易位、罗氏易位、倒位、复杂易位、致病性微缺失或微重复等）；②夫妇任一方或双方携带严重疾病的遗传易感基因突变；或具有生育遗传疾病子代高风险的夫妇，且致病基因突变诊断或致病基因连锁标记明确；③生育过严重血液疾病患儿的夫妇，需通过白细胞抗原配型行骨髓移植治疗。

1.2.2 排除标准 ①子宫内膜息肉或宫腔粘连者；②子宫内膜炎或子宫内膜癌者；③未行治疗的输卵管积水或宫腔积液者；④先天性子宫发育异常者，如畸形子宫或纵隔子宫者；⑤合并妊娠高风险、不能耐受的全身性疾病者。

1.3 PGT采用胚胎激光打孔法获取囊胚期3～10个滋养外胚层细胞，行全基因组扩增，通过高通量测序分析样本基因分型、基因拷贝数数据，检测23对染色体的非整倍体、染色体嵌合体以及节段性重复、缺失、易位等。活检后的胚胎进行玻璃化冷冻，直至移植前行冷冻复苏。

1.4 子宫内膜准备方案

1.4.1 NC组 平素月经规律、无排卵障碍者，于月经周期第8～10天开始，每隔2～3 d行超声检查，监测子宫内膜厚度及卵泡大小。当卵泡直径≥17 mm，子宫内膜厚度≥8.0 mm，结合雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平确定排卵日期。排卵后予黄体支持诱导内膜向分泌期转化，口服地屈孕酮（达芙通，荷兰苏威制药有限公司）30 mg/d联合阴道置入黄体酮软胶囊（安琪坦，法国Besins-healthcare公司）600 mg/d。内膜转化日后5～6 d行FET。黄体支持至检测人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日（移植后14 d检测血清β-hCG≥50 U/L为hCG阳性）。若成功妊娠，黄体支持至妊娠12周。

1.4.2 GnRHa+HRT组 平素月经不规律、排卵障碍或其他内膜准备方案失败者，于经期第2～3天给予长效醋酸曲普瑞林（达菲林，法国博福-益普生制药有限公司）肌内注射1.875 mg或亮丙瑞林（贝伊，丽珠集团丽珠制药厂）皮下注射3.750 mg。于注射亮丙瑞林14 d或醋酸曲普瑞林28 d后，口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国拜耳医药保健有限公司）4～6 mg/d，根据患者子宫内膜厚度及卵泡发育具体情况调整药量，12～14 d，内膜厚度≥8.0 mm，结合LH、E2、孕酮水平，黄体支持转化内膜（同NC组）。内膜转化日后第6～7天行FET，黄体支持至检测hCG日。若成功妊娠，黄体支持至妊娠12周。戊酸雌二醇用至检测hCG日后逐渐减量至停药。

1.4.3 HRT组 平素月经不规律、排卵障碍或既往子宫内膜薄者，口服戊酸雌二醇4～6 mg/d。用药12～14 d左右，内膜厚度≥8.0 mm以上，结合LH、E2、孕酮水平，黄体支持及移植时间同GnRHa+HRT组。

1.5 妊娠结局判定标准移植后4周进行阴道超声检查，宫腔内可见妊娠囊者定义为临床妊娠。胚胎于宫腔外着床定义为异位妊娠。妊娠14周之前胚胎停止发育或已经发生死亡并且未自然排出宫腔者定义为胚胎停育。妊娠不足28周或胎儿体质量不足1 000 g而终止妊娠者定义为流产。妊娠28周后分娩活婴定义为活产。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计分析。定量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验对其进行正态性检验，符合正态分布的定量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法；不符合正态分布的定量资料采用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Kruskal-WallisH检验；定性资料采用例（%）表示，组间比较采用卡方检验。采用多因素Logistic回归分析PGT患者FET妊娠结局的影响因素。所有检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者一般情况比较3组患者的年龄、不良孕产史、不孕时间、体质量指数（body mass index，BMI）、辅助生殖史、基础卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、基础LH、基础E2、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、催乳素（prolactin，PRL）及促排卵情况（获卵数、总囊胚率、优质囊胚率和囊胚培养率）比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。3组患者的PGT类型比较差异有统计学意义（P=0.002），NC组行PGT-SR的患者比例高于另两组（P＜0.05）。见表1和表2。

表1 3组患者的一般情况比较

表2 3组患者的排卵情况及PGT类型比较

2.2 3组患者FET情况及妊娠结局比较3组患者的可移植胚胎数、移植日子宫内膜厚度、临床妊娠率、流产率、胚胎停育率和活产率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。NC组的异位妊娠率高于GnRHa+HRT组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 3组患者FET情况及妊娠结局比较

2.3 活产组与非活产组的临床特征比较将所有周期分为活产组（138个周期）、非活产组（81个周期），活产组的BMI≤25 kg/m2、获卵数＞12个、可移植胚胎数＞2个、优质囊胚数＞2个的周期比例高于非活产组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 活产影响因素的单因素分析 [例（%）]

2.4 PGT患者活产的影响因素分析以妊娠结局活产为因变量（活产赋值0，非活产赋值1），将2组比较P＜0.2的临床特征因素包括不良孕产史、BMI、获卵数、总囊胚数、可移植胚胎数和优质囊胚数等指标作为自变量给予赋值后进行Logistic回归分析，结果显示优质囊胚数＞2个是PGT患者FET活产的保护因素（P＜0.05），见表5。

表5 PGT患者活产影响因素的Logistic回归分析

3 讨论

随着胚胎遗传学检测技术的发展和临床应用，PGT成为了较成熟、准确、安全且可靠的辅助生殖技术之一[4]。该技术显著提高持续妊娠率和活产率；降低流产率、多胎妊娠率及新生儿遗传性疾病风险，对优生优育有重要意义。众所周知，影响胚胎植入的因素主要有胚胎质量及子宫内膜容受性。尽管PGT助孕流程复杂，费用较高，对胚胎的质量也有一定的要求。但使用筛选过的正常及优质胚胎进行移植，已最大程度地降低因胚胎因素导致的不良妊娠结局。所以，为改善患者的妊娠结局，分析其他相关的影响因素显得极为关键。

3.1 PGT人群不同内膜准备方案对其妊娠结局的影响NC、HRT和GnRHa+HRT方案是常见的子宫内膜准备方案。对于月经周期规律、排卵正常的患者且子宫内膜厚度能达到移植标准，优先推荐NC方案[5]，仅在排卵前行月经周期监测，体内激素水平更接近自然状态，可预防高雌激素对内膜容受性的不良影响。但是，该方案的周期可控性较低，取消率较高（5%～6%）。HRT方案主要适于排卵不规律、无自发性排卵或多次采用NC周期失败者[5]，该方案补充外源性雌、孕激素促进内膜增殖并与胚胎发育同步化，可控性较强、复诊次数少、周期取消率低。但其成本增加，可能出现与补充雌激素有关的潜在不良影响，如血栓形成风险增加，内源性早发性的LH峰影响内膜微环境，不利于胚胎着床[6]。GnRHa+HRT方案则适于子宫肌瘤、子宫腺肌病、子宫内膜异位症者或其他内膜准备方案失败者。GnRHa可抑制内源性LH峰，并且提高子宫内膜对外源性雌激素的敏感性[7]，但周期长、费用较高。

本研究发现，临床上不同PGT类型的患者子宫内膜准备方案选择有差异。对于PGT-A患者，更倾向于选择人工周期内膜准备方案（GnRHa+HRT方案或单独HRT方案）。PGT-A患者更多因高龄、反复种植失败、复发性流产等选择该项助孕技术，该类患者可能有子宫内膜分型差、血供减少、宫腔微环境异常及子宫内膜容受性较低等问题，GnRHa+HRT方案或单独HRT方案可以获得与NC方案相似的妊娠结局[8-9]，所以针对既往有不良孕产史的患者更倾向人工周期。PGT-SR患者主要因染色体异常（易位、倒位、致病性微缺失或微重复等）前来就诊，这类患者的不孕病因较为明确，并非因异常的子宫内膜容受性，在月经周期及排卵规律的情况下，NC方案基本可满足胚胎着床的要求。

但是，上述3个方案的FET应用人群尚存在争议，尤其是PGT胚胎的子宫内膜准备方案的研究很少。一项大型Meta分析显示，没有足够的证据可以证明在FET的3种方案中哪种最优[10]。一项关于PGT-A患者的FET周期方案的研究发现，NC方案和HRT方案的临床妊娠率、流产率及活产率无显著差异[7]。同时，NC方案和HRT方案的PGT患者的临床妊娠率、活产率及早期流产率比较差异均无统计学意义[11]。本研究也发现，PGT患者的FET周期中，3组内膜准备方案的临床妊娠率及活产率相似。此外，本研究显示NC组的异位妊娠率高于GnRHa+HRT组，与HRT组无差异。既往研究表明，NC方案和HRT方案的异位妊娠风险差异无统计学意义（0.53%vs.0.47%，OR=1.12，95%CI：0.89～1.42）[12]。Pang等[13]也发现NC方案与HRT方案的异位妊娠率差异无统计学意义（1/98vs.1/76，P=0.877）。本研究与上述研究结论不一致可能是由于这些研究纳入的研究对象几乎是所有FET类型的体外受精/卵细胞质内单精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）患者，其不孕因素主要包括男方因素、输卵管因素、子宫内膜异位症和内分泌相关不孕等。异位妊娠的发生可能与输卵管功能及盆腔环境异常相关。本研究对象全部为PGT患者，但并非所有的PGT患者都需要进行输卵管通畅度及功能的检测。输卵管盆腔因素已是公认的异位妊娠的独立危险因素[14]。之前研究指出，胚胎植入宫腔时，输卵管功能如果受损将无法把胚胎送回宫腔，44%的胚胎会被推入输卵管中[15]。因此，推测在行NC方案解冻移植时，输卵管盆腔因素的异常很可能增加了异位妊娠发生率，但本研究样本量有限，需更大样本的研究进行证实。

3.2 PGT活产结局的影响因素本研究结果还显示，活产组中，BMI≤25 kg/m2、获卵数＞12个、可移植胚胎数＞2个、优质囊胚数＞2个的周期比例较高（P＜0.05）。超重和肥胖女性的生育力较差，其IVF/ICSI的活产率降低，可能与卵泡发育、卵母细胞质量、胚胎发育及宫腔环境等因素有关[16]。另外，获卵数、可移植胚胎数与活产的关系尚未统一。有研究表明，PGT-M/SR周期的活产率随着获卵数和可移植胚胎数的增加而上升[17]，与本研究结果一致。当获卵数超过10个，活产率趋于平稳，但也有其他研究指出，获卵数超过18个时活产率不再增加。这很可能与随获卵数增加的卵巢过度刺激综合征风险及未成熟卵比例增高有关[18]。在复苏及选择移植胚胎时，为了进一步改善妊娠结局，应优先考虑优质囊胚[19]。同样，在本研究中发现，优质囊胚数＞2个为PGT患者活产的保护因素。

3.3 结语针对PGT患者而言，3种常见内膜准备方案的临床妊娠率及活产率无明显差别，但NC组的异位妊娠率高于GnRHa+HRT组，推测与输卵管因素有关，PGT患者是否需要进行输卵管通畅度的检查，还需大样本的统计分析及进一步探究，在临床中可能需要注意。另外，PGT患者的活产率还可能与BMI、获卵数、可移植胚胎数及优质囊胚数等因素有关。因此，在促排卵周期中，尽可能让超重及肥胖的女性患者减重，把握卵巢刺激强度使获卵数控制在一定数量，尽量不低于12枚，但也要同时防止卵巢过度刺激。另外，要重视影响囊胚培养过程的不利因素，在安全有效的原则下，建议提高优质囊胚数（＞2个），而不是仅仅追求总囊胚数量。本研究的局限性在于，PGT样本例数有限（尤其是PGT-M类型），因此还需扩大样本例数及研究中心范围，深入个体化研究，进一步去阐述PGT患者与妊娠结局相关的影响因素，以提高PGT患者辅助生殖的活产率。