高迁移率族蛋白1对失血性休克大鼠缺血再灌注后肠屏障功能影响

王鑫宇，李 达，高广荣，马 锐，张 成，柳云恩

1.锦州医科大学 北部战区总医院 研究生培养基地，辽宁 沈阳 110016；2.北部战区总医院 普通外科，辽宁 沈阳 110016；3.沈阳医学院，辽宁 沈阳 110034

尽管，通过损伤控制性手术辅以合理的液体复苏策略，可使多数失血性休克(hemorrhagic shock，HS)患者得到成功救治，但仍有部分患者因循环衰竭或多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)死亡[1-2]。既往研究报道，肠黏膜对缺血较为敏感，是缺血-再灌注损伤时最易受累的器官[3]。其中，值得关注的是，尽管在合理液体复苏的支持下，仍有部分患者的肠上皮因无氧代谢和乳酸中毒而受损，导致屏障功能受损，引起大量炎性介质过度释放及细菌移位，最终发生MODS等严重并发症。在复苏期间采取诱导性低温(inducible hypothermia，IH)可以明显改善HS引起的有氧代谢紊乱及炎症反应，是改善HS患者预后、降低病死率的一种重要治疗手段[4-5]。高迁移率族蛋白1(high-mobility group box-1，HMGB1)已经被证实是一种能参与炎症反应的重要介质[6]。在应激状态下，HMGB1可作为细胞早期警报素，启动损伤相关分子机制，后期在氧化应激等刺激条件下，HMGB1可以从胞核中通过胞浆分泌到细胞外，促进炎症反应，加重组织缺血再灌注损伤。然而，其在HS条件下是否同样能诱发肠道炎性因子释放，损伤肠道屏障，目前相关报道较少。因此，笔者从HS发病的分子生物学角度着手，意图探究HMGB1是否具有调控HS鼠肠道细胞、损伤肠道屏障功能作用，为临床发展针对性治疗及研发新型药物奠定理论基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 成年Wistar大鼠[体质量180～200 g，平均体质量(189.0±5.7)g])，由北部战区总医院动物实验室提供；低温离心机(沈阳医疗器械有限公司)；BL-420E多导联生理记录仪(成都金凤有限公司)；压力传感器(新加坡Biosensors公司)；动物肛温计(北京冀诺泰科技发展有限公司)；大鼠手术器械(沈阳医疗器械有限公司)；聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(德国Biometra公司)；紫外线分光光度计(英国UV-visible Spectrometer公司)；血气分析仪(德国Bayer公司)；荧光定量PCR试剂盒(北京宝日医生物有限公司)；HMGB1引物合成(上海生工生物工程有限公司)；HMGB1抗体(英国Abcam公司)。

1.2 大鼠HS模型的建立 Wistar大鼠32只，随机分为常温复苏(N)组和低温复苏(H)组，每组各16只。以10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，进行气管插管辅助呼吸，分离左股动脉及左颈总动脉，分别用于放血及监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，左股静脉则用于复苏时液体回输。N组和H组放血速度控制在0.5 ml/min，放血量为20 ml/kg，总时间控制在10 min以内，将MAP维持在50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右90 min。抽取的血液储存于肝素化(7.5 U/ml)注射器中，置于4℃冰箱中保存。

1.3 HS复苏模型的建立 N组采用加热设备控制大鼠体温在38℃，H组采用酒精擦浴等方式控制大鼠体温在32℃；同时，回输放出的血液以及3倍放血量的林格液，复苏结束后恢复H组大鼠的体温，检测两组血流动力学变化。3 h后每组各处死8只大鼠，采集血液、肠系膜淋巴结及小肠标本，剩余鼠用于72 h生存分析。

1.4 定量PCR检测HMGB1 mRNA表达 RNA提取：将小肠标本捣碎，加入1 ml Trizol后震荡60 s，加入200 μl氯仿后震荡30 s，低温高速离心机离心15 min。取上清液加入等量异丙醇。再次离心15 min后，用75%乙醇清洗，随后加入40 ml RNase free water混匀，55℃金属浴5 min。使用紫外分光光度仪检测mRNA含量。cDNA反转录：采用TaKaRa反转录试剂盒，制备cDNA。PCR扩增：HMGB1引物序列，forward5-TCTTCCTCTTCTGCTCTGA-3，resever5‘-ATCTTCCTCCTCTTCCTTCT-3′；GAPDH引物序列，forward5-TGGACCTGACCTGCCGTCTA-3，resever5‘-GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。根据CT值按照2-△△CT法计算HMGB1在N组和H组中表达的相对水平。

1.5 蛋白印迹法检测HMBG1等蛋白表达 小肠标本悬液(40 μl)中加入4倍体积的细胞裂解液，12 000 r/min、4℃离心20 min后，收集上清液，使用考马斯蓝法进行蛋白定量。电泳分离样本后转移至硝酸纤维膜上，以BSA封闭，以BSA封闭1 h，分别加入HMBG1、Coroin 1A、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、白细胞介素(interleukin，IL)-4、神经丝蛋白-M(Neurofilament-M)、肾连蛋白(nephronection)、IL-17、胰岛素样生长因子-1受体(in sulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)、淀粉样蛋白前体蛋白结合家族A2(the amyloid precursor protein-binding protein A2 gene，APBA2)、IL-10、肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、Bax、CLP、白细胞共同抗原(CD45)及GAPDH的一抗(1∶1 000)，室温下沉淀1 h，4℃摇晃过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(1∶2 000)，于室温下静置2 h；最后利用ECL浸膜。采用图像分析仪对胶片进行分析。

1.6 血清炎性细胞因子检测 采用酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠血清中HMGB1、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的表达情况。

1.7 小肠细菌移位检测 将血液及肠系膜淋巴结标本称重，置于含有0.5 ml磷酸缓冲盐溶液中研磨，将匀浆按照300 μl/份均匀涂抹在培养基上，置于37℃培养箱中培养24 h，显微镜观测。

2 结果

2.1 HMGB1 mRNA表达 复苏后3 h，H组和N组小肠组织中HMGB1 mRNA表达均有所升高。H组大鼠小肠组织中HMGB1 mRNA表达水平明显低于N组，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。表明HS会刺激小肠细胞HMGB1表达升高，但低温复苏相比于常温复苏能有效降低HMGB1的表达，近而减轻炎症反应。

图1 HMBG1 mRNA表达变化

2.2 HMGB1等炎性相关细胞因子蛋白表达 复苏后3 h，N组和H组大鼠均可见小肠组织中包括HMGB1及多种炎症相关细胞因子蛋白的表达。其中，H组大鼠小肠组织中HMGB1、IL-4、Neurofilament-M、nephronection、酰基辅酶A氧化酶2(palmitoyl CoA oxidase 2，ACOX2)、IL-17、IGF-1R、APBA2、IRE1α、Bax、CLP和CD45表达明显低于N组，而Coronin 1A和IL-10表达明显高于N组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。表明低温复苏HS鼠的肠组织HMGB1等相关炎性细胞因子蛋白表达相对下调，抑炎因子表达相对上调，低温复苏HS鼠肠道受炎性细胞损伤较轻。

图2 HMGB1等炎性细胞因子蛋白表达变化

2.3 复苏大鼠血清炎性因子含量比较 复苏后3 h，H组大鼠血清中HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8明显低于N组，抑炎因子IL-10高于N组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。同样说明低温复苏可以降低HMGB1等炎性相关因子的表达。

图3 N组和H组大鼠血清炎性因子含量比较

2.4 复苏大鼠肠系膜淋巴结细菌含量比较 H组大鼠肠系膜淋巴结细菌移位个数为2个，平均细菌移位量为(21.34±0.91)×103CFU/ml；而N组大鼠细菌移位个数为5个，平均细菌移位量为(45.25±0.54)×103CFU/ml。两组平均细菌移位量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。说明低温复苏可以减少HS大鼠的肠道细菌移位。

2.5 两组大鼠生存情况比较 72 h生存分析结果显示，N组大鼠平均生存时间为(54.6±4.8)h，低于H组的(75.79±3.62)h，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

HS主要表现为患者全身和局部组织灌注明显不足，即使给予积极的复苏治疗有时也难以纠正患者的休克状态。而复苏治疗在纠正休克的同时又极易导致部分组织的再灌注损伤，不当的复苏不仅难以恢复患者的休克状态，反而会加重其组织器官的损伤。有研究报道，顽固性低血压和缺血-再灌注损伤可能是影响HS转归的直接原因[7]。在众多难治性HS患者中，学者们发现，肠黏膜对缺血最为敏感，易在缺血期间堆积大量代谢物质，进而诱发急性炎症反应，而在复苏治疗过程中，大量氧及白细胞会随着血液流入肠黏膜，最终导致难以控制的全身性炎症反应综合征[8]。

在笔者的前期研究中，已经证实了IH能够有效地提高复苏效率，改善HS引起的炎症反应，调整能量代谢平衡[9-10]。实际上，在休克等应激状态下，肠上皮细胞受损会释放警报素，启动炎症相关分子模式，通过多种模式识别受体如Toll样受体(toll-like receptors，TLR)4、糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)等，最终释放TNF-α、IL-6等炎性细胞因子，损伤肠黏膜屏障。因而，探究缺血-再灌注损伤导致肠屏障功能的分子机制，能为改善HS患者预后提供理论基础。

HMGB1能在应激状态下从细胞核中释放并进行乙酰化修饰，进而介导炎症反应。有研究报道，在肾发生缺血-再灌注损伤时，HMGB1从肾实质细胞核中大量释放，乙酰化后作用于下游靶点TLR-2/4等受体，引起多种炎性因子释放[11]。为了探究HMGB1对HS鼠肠屏障功能是否具有同样的作用，笔者通过构建N组与H组两组模型，分别检测两组鼠肠上皮HMGB1及其他相关炎性因子的表达情况，结果发现，H组大鼠小肠组织中HMGB1 mRNA及蛋白表达较N组明显降低，相关促炎因子也同样下调，而Coronin 1A和IL-10等抑炎因子表达明显升高，并且H组大鼠平均细菌移位量也明显减少，结果证实了，在IH复苏HS时，大鼠肠上皮细胞核HMGB1表达下调，其向胞质的分泌及乙酰化过程受阻，进而抑制TLR4、RAGE等识别受体，减少炎性因子的释放，减轻了肠屏障损伤，抑制肠道细菌移位，改善全身炎症反应综合征。本研究的结果与众多HMGB1相关研究结果[12-14]一致，初步明析了HMGB1在IH复苏中的相关分子机制。但IH时，机体具体通过何种机制导致HMGB1表达下调尚不可知，仍需后续实验继续探究。

综上所述，HMGB1表达下调可能是导致IH减轻大鼠HS肠屏障功能损伤的重要分子机制，为临床中治疗HS及预防缺血-再灌注损伤提供了一定的理论依据。但关于如何在临床患者中应用HMGB1拮抗剂来应对缺血-再灌注损伤带来的肠屏障功能障碍，仍需要更多的研究来证实。