印防己毒素对中年雌雄小鼠焦虑水平及学习记忆能力影响

段 梦 思， 项 楚 钦， 李 镜 娇， 亢 婷， 施 艳 芬， 付 玉

( 昆明理工大学 医学院， 云南 昆明 650504 )

0 引 言

学习记忆能力的损伤是衰老过程中常见的大脑认知功能障碍，早期未得到正确有效的治疗则会发展为更严重的神经系统疾病，如轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)与阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)，严重影响老年人的健康生活．中年是很多老年性疾病的萌发期，行为上也许表现多样，但其内在神经机理可能已经受到衰老过程的影响．例如，中年猕猴视皮层神经元的视觉反应特性有好有坏，但其神经元信噪比等却表现出一致退化[1]．因而，研究中年阶段的认知损伤过程对揭示老年阶段出现的认知障碍机理具有积极意义．

学习记忆损伤受多种因素调控，如突触可塑性、神经递质、外界环境因素等．其中，对神经递质的研究较多，大脑中神经递质主要分为两种：以谷氨酸为代表的兴奋性神经递质和以γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)为代表的抑制性神经递质[2]，通过抑制神经传递来降低神经元兴奋性，实现中枢神经系统兴奋/抑制平衡．GABAA受体在前额叶皮层、纹状体等脑区中均有分布，被激活后可以引起神经元超级化，进而抑制神经信号的传递[2]．GABA系统与学习记忆有着密切的关系，可参与调节突触可塑性、长时程增强、认知过程等[3]．该系统紊乱也是衰老与AD等神经退行性疾病的重要表现[4]．反之，通过调节GABA系统，进而恢复兴奋/抑制平衡是衰老及AD等神经退行性疾病干预与治疗的潜在靶标之一[5]．

印防己毒素(picrotoxin，PTX)是一种GABAA受体拮抗剂，可调控GABAA受体的异构位点[6]．在过去的研究中，PTX经常作为一种工具药，用于探讨衰老及相关疾病的药理或物理干预是否与GABA系统调节有关[7]．Fu等的前期研究发现，GABA受体调节能够影响衰老认知，如蝇蕈醇[8]、荷包牡丹碱[8]、巴氯芬[9-10]等能够增强或损伤中老年小鼠的空间记忆能力．此外，也有文献报道，PTX可恢复海马依赖性学习记忆损害小鼠的长时程增强[11]，以及非癫痫剂量的PTX可以逆转AD模型小鼠的记忆缺陷[12]．但有关PTX作为GABAA受体的拮抗剂是否影响衰老小鼠认知的研究报道非常有限．并且，文献显示PTX对GABAA受体的拮抗具有性别差异[13]，然而，关于PTX对衰老认知的影响是否具有性别差异，目前几乎没有文献报道．

本研究主要探讨PTX对中年雌雄小鼠认知的影响，实验通过腹腔注射PTX，采用旷场实验、Y迷宫实验、Morris水迷宫实验等行为学范式检测PTX组小鼠与对照组小鼠焦虑水平及学习记忆能力之间的差异．

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、仪器

实验动物为8～11月龄的C57BL/6野生型(wild type，WT)小鼠(昆明理工大学实验动物中心)，雌鼠10只(n(PTX)=5，n(生理盐水对照组)=5)，雄鼠19只(n(PTX)=9，n(生理盐水对照组)=10)．小鼠在自然昼夜节律(12 h光/12 h暗)下饲养于33 cm×20 cm×14 cm(长×宽×高)的饲养笼中，每笼5～6只．平均体质量31.36 g，喂食标准饲料(由苏州双狮实验动物饲料科技有限公司提供)及灭菌纯水(由昆明理工大学实验动物中心提供)，饲养间环境温度22～26 ℃，环境湿度55%～65%，小鼠从SPF级饲养间转移到普通饲养间适应环境4 d后开始进行实验．所有实验动物的操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》(2017年3月1日修订版)相关规定．

实验药物及仪器为PTX(ChemeGen公司)，生理盐水(昆明南疆制药有限公司)，一次性使用1 mL无菌注射器(江苏治宇医疗器材有限公司)，实验室自制水迷宫、Y迷宫、正方体敞箱．

1.2 分组及给药方法

实验分为4组，分别是雄性PTX实验组、雄性生理盐水对照组、雌性PTX实验组、雌性生理盐水对照组．经查阅相关文献，得到0.18 mg/kg为小鼠长期注射PTX的低剂量[7，13]．实验前将PTX溶于0.9%氯化钠注射液中配制0.18 mg/mL的药品20 mL备用，每次实验前，用注射器吸取1 mL PTX溶液定容至10 mL，得到0.018 mg/mL的注射液．每只小鼠的药物注射量为(体质量(g)×0.01) mL．对照组小鼠注射(体质量(g)×0.01) mL的生理盐水．

1.3 行为学测试方法

1.3.1 旷场实验 旷场(open field，OPF)实验，又称敞箱实验，主要用来观察啮齿类动物的自发性探索运动活性和焦虑行为[14]．本研究将通过OPF实验查看PTX的急性注射剂量是否影响小鼠的通常活动力．在不影响小鼠活动力的情况下，才进一步研究PTX对认知的影响．OPF实验中，小鼠总运动距离反映其活动水平，直立次数是其探索能力的指标，粪便颗粒、小鼠在中心区运动的距离及在中心区的停留时间反映其焦虑紧张行为．在本实验中，每只小鼠接受一次测试，将小鼠面壁放入黑色开口正方体箱(40 cm×40 cm×40 cm)任意一角中，规定箱子中心(20 cm×20 cm)区域为中心区，其余为外周区，摄像头固定于箱子正上方，允许小鼠自由探索5 min．每只小鼠测试完成后记录小鼠粪便颗粒数，之后用75%酒精擦拭箱子底部清理干净排泄物，去除上一只鼠留下的痕迹，避免影响下一只鼠的实验结果．实验过程中，用摄像头全程记录运动轨迹，以便后期分析其各项指标．

1.3.2 Y迷宫实验 Y迷宫(Y-maze)实验是检验啮齿类动物空间识别记忆能力的经典范式[15]．其总穿梭次数、行走距离等指标也可用来反映PTX长期注射对小鼠活动力的影响．本文Y迷宫由完全相同的3个臂(30 cm×8 cm×15 cm)组成，实验前将垫料放入Y迷宫中并在3个臂贴入不同的标识，以便小鼠学习记忆．Y迷宫中，以小鼠在3个臂的探索时间、移动距离、探索次数和总探索次数为检测指标．本实验分为训练期和检测期．首先用挡板将新异臂隔开，将小鼠从起始臂面壁放入，让其自由探索10 min，间隔一段时间后，检测小鼠的记忆能力，取消新异臂的挡板，将小鼠从起始臂面壁放入，让其自由探索5 min．每只小鼠训练或检测完成后，将垫料混匀，避免小鼠残留气味影响下一只鼠的实验结果．实验过程中，用摄像头全程记录运动轨迹，以便后期分析其各项指标．

1.3.3 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)实验是检验啮齿类动物空间学习记忆能力的经典范式[16]，本实验采用直径100 cm、高40 cm的水迷宫，将其分为完全相同的4个象限，用遮光布围挡起来并在遮光布和水迷宫内壁贴上不同的标志图案，以便小鼠学习记忆．水面下的隐藏平台直径为10 cm，将其放在任意一个象限，在水迷宫中注水使水面高于平台1.0～1.5 cm，向水中倒入100～150 g钛白粉，使水呈不透明状态．本实验分为适应期、训练期和检测期．实验时将水加热并维持在22～25 ℃．适应期1 d，将小鼠从任意位置面壁放入水中，使其自由游泳，找到平台后让小鼠在平台上停留15 s，适应平台安全区，若60 s小鼠仍未找到平台，则用木棍将小鼠引导上平台，并让其停留15 s．训练期5 d，每天进行4次训练，将小鼠从非平台象限面壁放入水中，让其寻找平台，记录小鼠的逃逸潜伏期(到达平台所需时间)，60 s为最大逃逸潜伏期，小鼠60 s内未找到平台则用木棍将其引导上平台，每次训练间隔15～20 min．检测期1 d，移除平台，将小鼠从目标象限的对侧面壁放入水中，让其自由游泳60 s，记录逃逸潜伏期、目标象限的穿梭次数、在目标象限的停留时间作为分析指标．实验流程如图1所示．

图1 实验流程图

1.4 统计方法

旷场实验和Morris水迷宫实验检测期用独立样本t检验分析组间差异．Y迷宫单个臂水平与随机水平33.3%对比使用单样本t检验．Y迷宫3个臂之间的差异使用重复测量方差分析．首先进行整体分析，重复因子(组内因素)是臂，有3个水平，组间因素是药，有2个水平．若组内因素出现显著性，就进一步分析每一组的组内因素是否显著，此时采用的也是重复测量方差分析，臂是主效应，主效应若是显著，进一步使用Post-hoc分析臂之间的差异，主要看新异臂与其他臂之间的差异．Morris水迷宫训练期采用的也是重复测量方差分析，重复因素为时间，有5个水平；组间因素是药，有2个水平．若组内出现显著性，就进一步分析每一组的组内因素是否显著．分析统计的软件为SPSS V10.0，作图软件为GraphPad Prism7.0．“*”表示有显著差异(0.01≤P<0.05)，“**”表示有极显著差异(0.001≤P<0.01)，“***”表示有非常显著差异(P<0.001)．Y迷宫相关图中，“^”表示与随机水平33.3%之间有差异．图中所有误差线值均为标准误．

2 实验结果

2.1 PTX对小鼠探究行为和紧张度的影响

旷场实验结果显示，雌性小鼠及雄性小鼠的活动水平和探索行为无差异，表现在小鼠于旷场中的总运动距离(雌性：t(8)=-0.405，P>0.05；雄性：t(17)=1.51，P>0.05)(图2(a))、直立次数(雌性：t(8)=1.516，P>0.05；雄性：t(17)=1.868，P>0.05)(图2(b))无显著性差异，即PTX对小鼠的运动行为能力无影响．但PTX显著降低了雄性小鼠在旷场中心区的停留时间(雄性：t(17)=2.954，P<0.01)(图2(e))，即增加了雄性小鼠的焦虑行为．

2.2 PTX对小鼠空间识别记忆能力的影响

Y迷宫实验结果显示，PTX对小鼠的运动行为能力无影响．表现在PTX不影响小鼠在3个臂的总穿梭次数(雌性：t(8)=0，P>0.05；雄性：t(17)=0.769，P>0.05)(图3(d))．且能够显著增加雌性小鼠的空间识别记忆能力，表现在雌性PTX组在新异臂的探索时间(t(4)=4.328，P<0.05^)及探索次数(t(4)=6.509，P<0.01^^)相对于随机水平33.3%有显著性差异(图3(a)、(b))，雌性生理盐水组与随机水平33.3%有差异(t(4)=3.208，P<0.05^)，说明雌性中年小鼠具有识别能力，但雄性生理盐水组与随机水平33.3%无差异，说明其已经有损伤．PTX组可增强雌性小鼠的这项差异，使其与其他两个臂之间也有显著性差异．PTX对雌性小鼠记忆的增强还表现在雌性PTX组在新异臂的探索时间(雌性：臂，F(2，16)=14.068，P<0.001(Post-hoc：生理盐水，F(2，8)=3.764，P>0.05；PTX，F(2，8)=11.069，P<0.01)；雄性：臂，F(2，34)=2.203，P>0.05)和探索次数(雌性：臂，F(2，16)=9.12，P<0.01(Post-hoc：生理盐水，F(2，8)=2.675，P>0.05；PTX，F(2，8)=28.921，P<0.001)；雄性：臂，F(2，34)=1.619，P>0.05)与第三臂之间有显著差异(图3(a)、(b))．

2.3 PTX对小鼠空间学习记忆能力的影响

Morris水迷宫实验结果显示，PTX不影响小鼠的游泳速度(雌性：t(8)=-0.219，P>0.05；雄性：t(17)=-0.023，P>0.05)(图4(d))，即不影响小鼠的运动能力．PTX对小鼠的学习能力无影响(时间，雌性：F(4，32)=2.394，P>0.05；雄性：F(4，68)=2.297，P>0.05)(图4(a))，但其增强了雌性小鼠的记忆能力，表现在雌性PTX组检测期小鼠逃逸潜伏期的缩短(t(8)=4.226，P<0.01)和目标象限穿梭次数的增加(t(8)=-3.025，P<0.05)(图4(b)、(c))．

2.4 长期注射PTX对小鼠空间识别记忆能力的影响

Y迷宫实验结果显示，长期注射PTX影响了雄性小鼠的运动能力，使其活动性降低，表现在雄性小鼠于Y迷宫中在3个臂的总探索次数的减少(雌性：t(8)=0.884，P>0.05；雄性：t(17)=3.226，P<0.01)(图5(d))．同时也显著增加了雌雄小鼠的空间识别记忆能力，表现在雌雄小鼠PTX组在新异臂的探索距离百分比相对于随机水平33.3%有显著性变化(雌性，PTX：t(4)=4.055，P<0.05^；雄性，PTX：t(8)=2.654，P<0.05^)(图5(a)、(c))，且PTX组在新异臂的探索距离与其他两个臂之间有显著性差异(雌性：臂，F(2，16)=7.695，P<0.01(Post-hoc：生理盐水，F(2，8)=2.762，P>0.05；PTX，F(2，8)=14.122，P<0.01)；雄性：臂，F(2，34)=7.480，P<0.01(Post-hoc：生理盐水，F(2，18)=2.597，P>0.05；PTX，F(2，16)=4.723，P<0.05))．

3 实验结果讨论

当前社会的医疗水平逐渐增强，人类的寿命也得到了有效的延长，这便加剧了社会的老龄化，各种老年相关疾病如阿尔兹海默病的患病率呈上升趋势，这些疾病往往伴随着学习记忆能力的下降，不仅降低了老年人的生活质量，也造成了老龄化家庭的沉重负担．现代医学仍未找到能有效增强衰老认知障碍人群学习记忆能力的治疗方法，因而实现健康老龄化，延缓或避免老年相关疾病的发生是目前全人类的共同愿望．

GABA是由GABA神经元释放并可与GABAA和GABAB受体特异性结合的抑制性神经递质，目前已有多种GABA系统药物被证明对学习记忆有积极影响，如GABAA激动剂毒蝇蕈醇(muscimol)[8]、GABAA拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline)[8]、GABAB激动剂巴氯芬(baclofen)[9-10，17]、GABAB拮抗剂CGP35348[18]等均可以改善认知缺陷大小鼠的学习记忆损伤．GABAA受体是控制氯离子通道的离子型受体，是一种大分子蛋白质，主要在外周和中枢神经系统中表达，包含GABA、印防己毒素、巴比妥酸盐及麻醉类固醇的特异性结合位点[19]．GABAA受体通常是由α-、β-和γ-亚基组合而成，最常见的组合形式为α1β2γ3．而GABAA受体的β亚基被认为是PTX位点的必要条件[20]．PTX作为GABA系统拮抗剂，经常被用于研究其与学习记忆能力的关系．本研究以此为基础，研究PTX的作用效果，检测了PTX对中年雌雄小鼠焦虑水平及学习记忆能力的影响，结果发现，PTX对雌雄小鼠的焦虑行为和学习记忆能力的影响存在明显的性别差异．PTX能有效增强雌性小鼠的空间识别学习记忆能力，但也增加雄性小鼠的焦虑行为，长期注射PTX也能提高雄性小鼠的学习记忆能力，但会影响小鼠的自发性探索活动力．

此前已有研究通过高架十字迷宫(elevated plus maze，EPM)证明，PTX可以增加小鼠的焦虑行为[21]．由于EPM处于高空，会使小鼠本身的恐惧增加，产生焦虑，故本文采用开放性旷场实验来检测小鼠的焦虑行为，这样可以减少小鼠本身的恐惧效应，同时也可以检测PTX急性注射对小鼠活动力的影响．本文得出的结果与其相一致，PTX显著增加了雄性小鼠的焦虑行为，但急性注射PTX不会影响小鼠的活动能力．

在检测空间识别记忆方面，本文采取了自发状态的Y迷宫实验，该迷宫由啮齿类动物与生俱来的好奇心驱动小鼠探索从未访问过的区域，同时避免了奖赏和惩罚制度对小鼠空间识别记忆的影响，是评价小鼠短期记忆能力的重要范式[22]．在第一次注射PTX后，进行了间隔1 h的Y迷宫实验，发现PTX能够显著增加雌性小鼠的空间识别记忆能力，但对雄性小鼠的记忆能力无影响．由于使用的小鼠年龄较大，已经出现了记忆损伤，对照组小鼠也不能很好地识别新异臂，故降低了Y迷宫的间隔期．在其余行为学实验进行完后，又进行了一次间隔30 min的Y迷宫实验，同时也可以评价长期注射PTX对小鼠空间识别记忆能力的影响，发现长期注射PTX可以显著增加雌雄小鼠的空间识别记忆能力，也影响了雄性小鼠的探索能力．

在检测长期空间学习记忆方面，采取了具有强迫游泳性质的Morris水迷宫实验[23]，依靠水迷宫内壁及其周围遮光帘上的远端线索，小鼠从起始位置开始定位水下逃生平台，通过重复实验评估其空间学习记忆水平，水迷宫实验可以有效减少气味追踪的干扰．进行了为期5 d的水迷宫训练，并未发现学习上的差异，但在记忆能力的检测上发现，PTX可以增加雌性小鼠的记忆能力且小鼠的游泳速度并未受到影响．

4 结 语

本研究表明GABAA受体在学习记忆过程中起着重要作用．GABAA系统拮抗剂对小鼠的影响具有性别差异．在行为学水平上发现，PTX能有效增强雌性小鼠的短期和长期记忆能力，长期注射PTX也能增强雄性小鼠的短期记忆能力，但PTX会增加雄性小鼠的焦虑行为，且影响其活动水平．这可能是PTX的剂量依赖性造成的，因为PTX对雌性小鼠的半数有效剂量(ED50)比雄性小鼠大[13]，除此之外，性腺激素也会影响PTX的敏感性[24]．未来将进一步寻找PTX改善雌雄小鼠记忆能力的最佳剂量及注射周期，并在神经电生理水平上探究检测PTX对小鼠兴奋/抑制平衡的影响．在后续研究探讨PTX认知干预的机制时需要更加注意该药作用的性别差异．