白刺链霉菌CT205对南方根结线虫的毒杀作用及盆栽防效

金涵,李梦雅,姚感,王小姣,王世梅

(南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物协同创新中心/教育部资源节约型肥料工程技术研究中心,江苏 南京,210095)

植物根结线虫(Meloidogyne)是一类重要的土传病原物,据文献报道我国约有50%的温室蔬菜存在不同程度的根结线虫危害,造成严重的经济损失[1]。目前,使用化学农药是防治线虫病害的主要措施,但农药残留污染环境,破坏土壤微生物区系,影响食品安全,是发展绿色农业的主要障碍,通过生物防治或生态调控措施控制线虫病害是目前国内外研究的热点。

生防放线菌能够产生拮抗植物病原菌的挥发性有机化合物(volatile organic compound,VOC)和非挥发性有机化合物(nonvolatile organic compound,NVOC),因此成为当前设施农业中防控土传病害的重要研究对象[2-4]。Schöller等[5]研究发现放线菌可以产生烷类、烯烃、酯、醚、醇、酮、胺类等120多种挥发性有机化合物。文献报道VOC可作为生态系统群落间的信号物质,具有杀死植物寄生线虫、促进植物生长或抑制病原菌等作用[6]。Groenhagen等[7]借助GC-MS分析检测链霉菌FORM5产生VOC的主要成分为链霉吡啶(streptopyridines),该物质可用作链霉唑啉抗生素生产的指示剂。南昌链霉菌(Streptomycesnanchangensis)32代谢产生的南昌霉素(nanchangmycin)和阿维链霉菌(S.avermitilis)代谢产生的阿维菌素(avermectins)均具有高活性的杀线虫作用,在农业生产中得到广泛应用[8-9]。

本文以实验室保存的生防放线菌菌株——白刺链霉菌(Streptomycesalbospinus)CT205为材料开展研究,前期研究发现CT205对尖孢镰刀菌、疫霉等多种植物病原真菌具有强烈的抑制效果,防控草莓根腐病、黄瓜枯萎病田间效果良好[10-11],CT205经液体发酵产生的次生代谢产物经鉴定为环己酰亚胺[12]。本研究首先测定菌株CT205产生的VOC及NVOC杀线虫活性及抑虫卵孵化能力,并采用黄瓜盆栽试验,验证CT205制剂对黄瓜根结线虫病的生防效果,旨在为黄瓜根结线虫病的防控提供新的生防途径。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与线虫

白刺链霉菌CT205由本实验室分离保存。南方根结线虫(Meloidogyneincognita)由南京农业大学植物保护学院植物线虫实验室李红梅教授提供。

1.2 供试培养基

种子培养基:葡萄糖45.0 g,黄豆粉30.0 g,酵母粉5.0 g,CaCO35.0 g,去离子水1 000 mL,pH7.5。发酵培养基:蔗糖20.0 g,可溶性淀粉30.0 g,黄豆粉8.0 g,CaCO33.0 g,蛋白胨2.0 g,NaCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO4·7H2O 0.5 g,去离子水1 000 mL,pH8.0。麦粒培养基:80%小麦+20%小米浸泡过夜后热水煮至表皮开裂后过滤,晾干多余水分,每瓶100 g,121 ℃灭菌20 min,冷却备用。

1.3 白刺链霉菌CT205发酵上清液、麦粒培养物与固体制剂的制备

种子液培养基灭菌后,接种新鲜的CT205斜面孢子2～3环(250 mL三角瓶中50 mL种子液),28 ℃、170 r·min-1培养48 h。种子液培养完成后显微镜观察菌丝体形态,接种至发酵液体培养基中(500 mL三角瓶中100 mL发酵液),接种量10%,28 ℃、170 r·min-1培养5 d。培养结束后4 ℃、6 000 r·min-1离心 15 min 去除菌体,即可获得CT205发酵上清液,用生物测定法[12]检测上清液中环己酰亚胺的含量。

接种环挑取白刺链霉菌CT205少量孢子于 PDA液体培养基中,28 ℃、170 r·min-1培养5 d,以1%(体积分数)接种量接种至灭菌麦粒培养基上充分混匀,28 ℃培养14 d。每隔3～4 d摇动麦粒培养基确保其均匀生长,即可获得CT205麦粒培养物。

选用CT205利用情况较好的麸皮、黄豆粉、米糠、稻壳等固体物料,物料配比(质量分数)分别为麦麸50%、小米粉12%、黄豆粉3%、玉米粉3%、米糠12%、稻壳20%、CaCO30.3%,装于500 mL三角瓶中,每瓶装入50 g培养基质,固液质量比为1∶0.8,搅拌均匀后,121 ℃湿热灭菌30 min,冷却至30 ℃左右时,接入10%种子液,28 ℃培养14 d,即可获得CT205固体制剂。

1.4 南方根结线虫的培养和分离

根结线虫繁殖和保存一般采用番茄作为寄主植物。参照彭双等[13]的培养方法,番茄种子经催芽及表面消毒后进行催芽处理,待种子露白后播种进行穴盘育苗。盆钵用土选用沙质土壤,土和沙等质量混合,高温灭菌2 h后使用。将感染根结线虫的植株病根切成小块,混拌于灭菌后的沙土中,移栽已长出4片真叶的番茄幼苗。温室培养40～50 d后采集番茄病根,清水洗净根系,用镊子轻挑根系表面的卵块,使用1%次氯酸钠溶液振荡处理卵块1 min,待卵块溶解后先过孔径为75 μm网筛,再通过孔径为25 μm网筛过滤以收集线虫卵。将部分线虫卵悬液置于孵化筛内,25 ℃恒温孵化,每隔24 h收集二龄幼虫J2s,并加入一定量的无菌水将其配制成1 000条·mL-1左右的悬浮液备用。供试线虫即用即取。

1.5 白刺链霉菌CT205发酵上清液对根结线虫J2s和虫卵的毒杀作用

取1 mL发酵上清液加入灭菌离心管中,以无菌发酵培养基上清液作为对照(CK),加入线虫悬液 200 μL,25 ℃静置培养。共设置5个处理,处理时间分别为3、6、12、18和24 h,每个处理5个重复。小心吸除1 mL上清液,加入浓度为20 g·L-1的NaCl溶液混匀。取10 μL(观察的线虫总数不少于30头)混合液点到载玻片上,5 min后在4倍光学显微镜下计数死亡线虫数(线虫僵直不动视为死亡)及线虫总数,计算各处理死亡率及校正死亡率。死亡率=死亡线虫数/10 μL混合液中线虫数×100%;校正死亡率=(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)×100%。

取1 mL发酵上清液加入灭菌离心管中,以无菌发酵培养基上清液作为对照(CK),加入约有200粒卵的新鲜卵悬液,25 ℃恒温培养。共设置5个处理,处理时间分别为24、48、72、96和120 h,每个处理5个重复。用显微镜观察并记录孵化线虫数,计算卵孵化率和相对抑制率。卵孵化率=孵化线虫数/供试卵数×100%;相对抑制率=(对照孵化线虫数-处理孵化线虫数)/对照孵化线虫数×100%。

1.6 白刺链霉菌CT205挥发性有机化合物(VOC)对根结线虫的毒杀作用

1.6.1 白刺链霉菌CT205产VOC组分的检测方法从培养14 d的麦粒培养物及空白对照(CK)各取 40 g 放入50 mL三角瓶中,封口膜封口,于60 ℃恒温水浴锅中平衡40 min后回收萃取头,立即插入气相色谱-质谱(GC-MS,Ageilent 7890A,美国)进样孔,于250 ℃解吸3 min进行分析。气相色谱-质谱条件[14]:石英毛细管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)(美国Agilent公司);升温程序:起始温度40 ℃,平衡 1 min 后,以3 ℃·min-1的速度升至108 ℃,平衡2 min,再以5 ℃·min-1升至180 ℃;电子轰击离子源(EI)温度为230 ℃,电子能量70 eV,传输线温度260 ℃,四级杆温度150 ℃,全扫描质量范围为45～550m/z。进行峰面积积分,系统导出所得挥发性物质,在国际标准数据库(Library of the National Institute of Standards and Technology,NIST)中进行物质比对,鉴定出挥发性物质成分。

1.6.2 白刺链霉菌CT205 VOC杀线虫活性检测使用二分平板来检测CT205 VOC的杀线虫活性。向二分平板一侧加入不同质量的CT205麦粒培养物,另一侧加入5 mL含300条左右新鲜孵化的J2s线虫悬液,以不同质量未接菌的麦粒培养物为空白对照,25 ℃静置72 h。共设置6个处理,处理中不同麦粒培养物质量分别为0、1、2、4、8和16 g,每个处理3个重复。计算各处理死亡率及校正死亡率,测定方法参照1.5节。

1.7 白刺链霉菌CT205固体制剂对黄瓜根结线虫病的盆栽防效测定

取南京东郊麒麟镇种植黄瓜大棚土壤(黄棕壤),土壤有机质含量为31.74 g·kg-1,总氮含量为1.27 g·kg-1,有效磷含量为150.43 mg·kg-1,速效钾含量为254.21 mg·kg-1,pH6.37。

‘津春4号’黄瓜种子经催芽育苗后,将两叶一心的黄瓜幼苗移栽至盆钵中,每盆700 g灭菌土,每盆接种600条左右新鲜孵化的根结线虫J2s。移苗前混施2% CT205固体制剂验证其防效,以不接固体制剂作为对照,每个处理10盆。42 d后观察黄瓜植株生长及发病情况,并进行生物量测定。将黄瓜根系小心拔出,对根结量进行计数,计算病情指数。采用贝尔曼漏斗法收集土壤及根结中线虫并统计其密度。

根结发病情况调查。根结线虫病分级标准[15]:0 级:根系健康,没有根结;1级:根系根结比例<25%;2级:根系根结比例为25%～50%;3级:根系根结比例为50%～75%;4级:根系根结比例达75%以上。病情指数=[∑(各级代表值×本级病株数)/(调查总株数×最高级代表值)]×100%;防治效果=[1-(处理病情指数/对照病情指数)]×100%。

1.8 数据处理与分析

数据处理采用Excel 2010和SPSS 25.0软件进行统计分析。在0.05水平上进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 白刺链霉菌CT205发酵上清液对根结线虫J2s和虫卵的毒杀效果

2.1.1 白刺链霉菌CT205发酵上清液对J2s的毒杀效果随着处理时间的延长,CT205发酵上清液对线虫的毒杀效果逐渐增加(图1),线虫J2s死亡率显著升高,其形态也出现了不同程度的变化。3 h时,CK处理中无J2s死亡,虫体表面角质层光滑,轮廓明显,体内结构清晰;CT205发酵上清液处理中校正死亡率为5.94%,死亡线虫呈现僵直状态(图2)。12 h时,CK处理中J2s死亡率为3.27%,CT205发酵上清液处理中校正死亡率为40.85%,少数死亡线虫虫体表面角质层皱缩,虫体内容物出现溶解现象。24 h时,CK处理中J2s死亡率仅为6.94%,CT205发酵上清液处理死亡率则为91.80%,与CK相比,其校正死亡率高达91.21%,部分线虫虫体内容物明显消解,出现渗漏现象。总体来看,CT205发酵上清液处理的J2s死亡率均显著高于CK处理;在CT205发酵上清液处理中,不同处理时间之间根结线虫J2s死亡率都差异显著,其中24 h时对J2s的毒杀效果最显著。

图1 不同处理时间下CT205发酵上清液对根结线虫J2s的毒杀效果Fig.1 The nematicidal effect of CT205 fermentation supernatant on root-knot nematode J2s under different treatment times 1)CK. 对照处理Control treatment;CT205. CT205发酵上清液处理Treatment of CT205 fermentation supernatant. 2)不同小写字母表示在0.05水平差异显著,下同。Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level,the same as follows.

图2 不同处理的根结线虫J2s形态观察(10×40)Fig.2 Morphological observation of root-knot nematode J2s after different treatments

图3 不同处理时间下CT205发酵上清液 对根结线虫的抑卵孵化效果Fig.3 The inhibitory effect of CT205 fermentation supernatant on root-knot nematodes egg hatching under different treatment times

2.1.2 白刺链霉菌CT205发酵上清液对根结线虫的抑卵孵化效果在不同处理时间,CT205发酵上清液处理的单卵孵化率与CK相比均存在显著差异(图3)。随着处理时间的增加,各处理卵孵化率呈上升趋势。24 h时,CK处理中卵孵化率为34.10%,CT205发酵上清液处理中卵孵化率为9.96%,相对抑制率为70.79%。48 h 时,CK处理中卵孵化率为66.4%,CT205发酵上清液处理中卵孵化率达10.14%,相对抑制率达84.72%,处理效果最好。72～120 h各处理线虫卵孵化率无显著增加,CT205发酵上清液处理的虫卵孵化率均显著低于CK处理,相对抑制率超过80%。

2.2 白刺链霉菌CT205 VOC的组分及对根结线虫的毒杀效果

2.2.1 VOC的组分的检测菌株CT205产挥发性物质的GC-MS图谱见图4。对照标准物质数据库检索,菌株CT205产生的VOC主要有烯烃、醇、醚、酮、醛等,并可看出各组分的出峰时间及相对含量。菌株CT205产生的主要VOC见表1,如烯烃类物质2-甲基-2-冰片(2-methyl-2-bornene,13.370 min,28.836%),醇类物质2-甲基异冰片(2-methylisoborneol,21.131 min,21.950%),烯烃类物质 1,3-环戊二烯(1,3-cyclopentadiene,10.833 min,5.460%)、佛术烯(eremophilene,32.582 min,0.908%)、萘(naphthalene,33.401 min,0.665%)、(-)-β-蒎烯[(-)-β-pinene,10.650 min,0.357%]等。

图4 菌株CT205产生的挥发性有机化合物(VOC)的GC-MS图谱Fig.4 GC-MS spectra of volatile organic compounds(VOC)produced by strain CT205

表1 CT205产生的VOC组成Table 1 The composition of VOC produced by strain CT205

图5 不同质量麦粒培养物处理 对根结线虫J2s的毒杀效果Fig.5 The nematicidal effect on root-knot nematode J2s with different weight of wheat grain culture treatments

2.2.2 VOC对根结线虫的毒杀效果不同质量CT205麦粒培养物处理根结线虫J2s 72 h后,随着麦粒培养物质量的增加,对根结线虫J2s的毒杀效果也增强。由图5可知:CK处理中线虫死亡率为 6.15%,当麦粒培养物小于4 g时,VOC处理后的J2s死亡率与CK相比无显著差异。当麦粒培养物大于4 g时,J2s死亡率逐渐上升,显著高于CK,且随着麦粒培养物质量增大,对根结线虫的毒杀效果呈现显著增长的趋势。当麦粒培养物质量为16 g时J2s死亡率最高,为53.70%,校正死亡率为50.66%。

2.3 白刺链霉菌CT205固体制剂制备

28 ℃培养3 d后观察固体物料发现,CT205白色菌丝在固料中蔓延生长,摇匀后继续培养至5～7 d时,菌体开始产孢。取样制片,用显微镜观察可发现大量分生孢子。培养14 d时终止发酵,CT205孢子呈灰白色,散发强烈的“土腥味”,对固体制剂稀释后进行涂布,CT205活菌数达9.0×108CFU·g-1。固体制剂中活性成分含量采用生物法测定,标准曲线为Y=0.029X+1.756,R2=0.993 7(Y为抑菌圈直径,X为环己酰亚胺含量)。生物测定固体菌剂中环己酰亚胺含量为45.88 μg·g-1。

2.4 白刺链霉菌CT205固体制剂对盆栽黄瓜根结线虫的防效

如表2所示:CT205固体制剂处理黄瓜植株的病情指数、土壤中线虫密度、根中线虫密度均显著低于CK处理。由图6可以看出:CK处理中黄瓜地上部出现明显的发病症状,植株明显矮化,叶片褪绿发黄,出现萎蔫或逐渐枯黄,而CT205固体制剂处理中地上部分症状表现不明显,植株生长势良好,叶片未出现失绿现象。CK处理中黄瓜植株须根及侧根染病,出现大小不一的瘤状根结,而CT205固体制剂处理中根系根结较少。对根结量进行计数,CK处理根结指数为65.70%,CT205固体制剂处理根结指数为22.70%,防治效果为45.80%。施用CT205固体制剂与CK相比,黄瓜植株生物量增加,主要表现为株高、黄瓜植株地上部鲜重。黄瓜株高、地上部鲜重较CK分别增加63.07%和59.10%,但地下部鲜重没有显著变化。

表2 不同处理对盆栽黄瓜根结线虫的防效Table 2 The control effects on cucumber root-knot nematode with different treatments

图6 不同处理黄瓜发病及生长情况对比Fig.6 Comparison of cucumber incidence and growth in different treatmentsA,C. 对照处理Control treatment;B,D. CT205固体制剂处理 CT205 solid preparation.

3 讨论

放线菌作为一类广泛存在于土壤中的优势微生物类群,通过拮抗或产生杀线虫特性的化合物有效防治根结线虫。其最重要的特征就是能够产生多种拮抗线虫活性的次级代谢产物,如抗生素、杀虫剂等[2,16]。曾庆飞等[17]将白浅灰链霉菌(S.albogriseolus)HA10002的杀线虫活性物质鉴定为诺卡胺素,具有抗菌和诱导昆虫BM-N4细胞形态发生改变的作用。谭卓等[18]对委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)Snea253的代谢活性物质进行分离鉴定,发现其产生的邻苯二甲酸二丁酯兼具高效抗线虫活性和抑菌活性。乔茜[19]研究发现链霉菌TD-1产生的VOC对南方根结线虫J2s及虫卵均具有较好的抑杀活性。CT205代谢产生的VOC对根结线虫J2s具有较好的毒杀效果,但对线虫起抑制作用的具体物质有待进一步检测。CT205代谢产生的NVOC对根结线虫J2s具有较好的毒杀效果,对线虫虫卵也具有较强的抑卵孵化活性。本实验室前期研究发现CT205液体发酵产生的活性物质是环己酰亚胺,其作为蛋白抑制剂可以有效抑制真核生物蛋白质的合成,这是CT205发酵上清液毒杀根结线虫的机制。

生防菌株应用于控制根结线虫多有文献报道。Choi等[20]研究发现苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)KYC和贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensis)CE100在体外及体内条件下均具有防治植物根结线虫的作用,且能够促进植物生长。Bui等[21]鉴定了3株菌(Bacillussp.、Paenibacillussp. 和Xanthomonassp.)产生的VOC对水稻根结线虫(Meloidogynegraminicola)的防效,通过体外和植物双室盆栽试验,发现3株菌产生的VOC对根结线虫J2s均具有较好的杀线虫活性,对易感水稻的病情指数具有显著降低作用。放线菌杀虫物质的筛选主要集中在链霉菌,因此开发利用生防链霉菌进行生物防治已成为防治根结线虫病的高效安全的途径。接种生防链霉菌可以有效防治植物根结线虫病。周银丽等[22]研究发现公牛链霉菌(S.tauricus)JS2兼具拮抗石榴枯萎病菌及抑杀南方根结线虫的活性。张琦等[23]利用空心菜小盆栽试验研究淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)LY4对南方根结线虫的杀伤活性,结果防效达71.10%。本研究制备的白刺链霉菌CT205固体制剂,通过盆栽试验研究其对黄瓜根结线虫病防效,结果证明CT205固体制剂可以促进黄瓜植株生长,增加黄瓜植株的生物量,但施用CT205固体制剂与CK地下部鲜重没有显著变化,推测CK处理中根结线虫侵入黄瓜根系造成根结膨大,因此虽然CT205菌剂处理黄瓜根系更为发达,但二者地下部鲜重差异并不显著。同时,CT205固体制剂也可有效降低黄瓜根结线虫病的发病情况,对黄瓜根结线虫病有较好的防效。本研究中CT205产生的次生代谢物质具有高效杀线虫活性,且前期盆栽试验研究发现CT205制剂施入土壤中可以改善黄瓜根系微生物群落结构,增加对线虫有拮抗作用的潜在有益菌属(如溶杆菌属)等的丰度[24]。以上研究结果可解释CT205对黄瓜根结线虫病防效良好的原因,但防控线虫病害机制仍需进一步探索。