食品中椰毒假单胞菌微滴式数字PCR定量检测方法的建立

2023-02-02李会杰董莲华陈桂芳刘思渊杨佳怡杨靖亚

生物技术通报 2023年1期

李会杰董莲华陈桂芳刘思渊杨佳怡杨靖亚

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.中国计量科学研究院前沿计量科学中心，北京 100029；3.沈阳化工大学化学工程学院，沈阳 110142）

椰毒假单胞菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧菌，多生长在谷类发酵制品、薯类制品、变质银耳等食品表面［1-2］。该菌在一定条件下产生米酵菌酸和毒黄素两种脂肪酸类小分子物质，具有毒性作用［3-4］。其中，米酵菌酸毒性较强，它结合线粒体中转运二磷酸腺苷/三磷酸腺苷（ADP/ATP）载体，影响ATP 代谢途径，导致细胞死亡［5-6］。流行病学分析表明，椰毒假单胞菌食物中毒具有地域性特点，且具有明显的季节性，主要发生在中国、东南亚以及非洲地区，多发于夏秋季［2，7］。2010年到至今，在我国广西、云南、浙江、贵州、广东、黑龙江等地陆续报道了多起椰毒假单胞菌食物中毒事件，造成中毒者严重的身体机能损害甚至死亡［8-10］。

目前，椰毒假单胞菌食物中毒的解毒药物尚未发现，细菌及其外毒素的检测可从源头监测污染状况，避免中毒事件的发生。根据GB 5009.189-2016《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》，经过样品提取、过滤后，进行高效液相色谱法分析［11］。该方法操作繁琐，检测结果易受基质干扰，无法满足复杂基质食品中米酵菌酸的快速定量分析要求。气相色谱或液相色谱与质谱串联分析也被用于食品中米酵菌酸的检测，但仪器要求较高，对现场检测有一定的限制，对较低浓度米酵菌酸，存在漏检的可能［12-13］。针对食品中椰毒假单胞菌的检测是更为直接的方法，具有重要意义。根据GB 4789.29-2020《食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的检验》［14］，通过增菌培养、选择性培养基分离、生化鉴定和血清学实验等过程进行检验，该方法检测周期长，无法实现对食品中椰毒假单胞菌的快速定量检测，不利于中毒者的及时诊治。核酸体外扩增的检测方法具有迅速、灵敏度高、特异性强等优势。马晓燕等［15］建立环介导等温扩增技术，利用特异性引物在恒温条件下对椰毒假单胞菌16S-23S rRNA 序列进行快速扩增，将扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳检测，通过观察条带验证是否存在细菌污染，该方法只能实现定性。林捷等［16］针对16S-23S rRNA 序列进行实时荧光定量PCR 检测（quantitative real-time PCR，qPCR），该方法依赖标准曲线进行相对定量，标准曲线的准确性直接影响定量结果的准确性。

微滴式数字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）因特异性强、灵敏度高等优势在食源性致病菌的定量检测方面应用广泛，提高了食源性致病菌的检测效率［17-18］，如大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌等［19-20］。ddPCR 使DNA 分子随机、独立地分布在每个反应单元，对单个DNA分子进行PCR 反应后对荧光信号计数，结合泊松分布得到DNA 分子拷贝数，无需依赖标准曲线即可实现对样品的绝对定量检测。魏咏新等［21］针对大肠埃希氏菌O157∶H7 单拷贝基因hlyA 建立ddPCR 方法，对人工污染的三文鱼样品进行特异性定量检测，检出限为110 CFU/g。在食品基质中对鼠伤寒沙门氏菌的要求是零检出［22］，Wang 等［23］针对鼠伤寒沙门氏菌FimY基因建立ddPCR 方法，快速定量检测人工污染牛奶样品，检出限为250 CFU/mL。在上述研究中，研究者通过比较ddPCR 和qPCR 方法的定量检测结果，发现ddPCR 检出限更低。针对椰毒假单胞菌污染发酵米面等食物导致严重的食物中毒，且目前没有准确定量检测方法的现状，本研究根据16S-23S rRNA 序列，建立了椰毒假单胞菌ddPCR定量检测方法，ddPCR 对人工污染糯米汤样品的检出限为361 CFU/mL 与平板计数法相比，ddPCR 方法缩短了检测周期，有利于食品中椰毒假单胞菌的快速准确检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂细菌基因组DNA 提取试剂盒（货号：A1120，天根生化科技有限公司）；上下游引物、探针（上海英潍捷基贸易有限公司）；培养基（北京路桥技术股份有限公司）；密封垫（Gaskets for QX200/QX100）、微滴发生卡（Cartridges for QX200/QX100）、ddPCR 预混液、微滴发生专用油、微滴分析专用油（美国Bio-Rad 公司）；实验所用菌株详见表1，其中椰毒假单胞菌标准菌株（CICC10574）和黄曲霉标准菌株（CICC2219）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC），其它标准菌株为实验室保存。所有菌株均在各自的指示培养基上活化后备用。

表1 实验用菌种Table 1 Strains for experiment

1.1.2 仪器与设备 Veriti PCR 仪（美国 Applied BioSystems 公司）；微滴分析仪、微滴生成仪（美国Bio-Rad 公司）；Nanodrop2000 超微量紫外分光光度计（美国Thermo 公司）；LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR 仪（德国Roche 公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针的设计为实现对椰毒假单胞菌的特异性检测和绝对定量分析，选取该菌中具有高度种属特异性且高度保守的16S-23S rRNA 序列（基因号 EF552059）作为靶序列，利用Primer Express软件设计引物和探针，并通过NCBI 在线工具进行序列分析和比对，引物和探针序列见表2。探针5'端以荧光基团FAM 标记，3'端以淬灭基团BHQ 标记。

表2 ddPCR 引物和探针序列Table 2 Primers’ and probes’ sequences of ddPCR

1.2.2 基因组DNA 提取将椰毒假单胞菌（CICC10574）接种于LB 液体培养基中，于37℃、220 r/min 摇床过夜培养。用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer Saline，PBS）对过夜培养菌液进行10倍梯度稀释，至108稀释度。取各稀释度菌液1 mL，用细菌基因组DNA 提取试剂盒（天根，货号：A1120）分别提取基因组DNA。操作步骤参照试剂盒说明书，最后，用50 μL TE 缓冲液洗脱提取的基因组DNA。

1.2.3 平板计数取1.2.2 中10 倍梯度稀释的椰毒假单胞菌纯培养菌液进行平板计数，取100 μL 各稀释度菌液加到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）内，用涂布棒均匀涂开后，37℃倒置培养24±2 h，每个稀释度做3 个平行。保证菌落数在（20-300）CFU 范围内、无蔓延菌落生长，计数结果取3 个平板计数结果的平均值。

1.2.4 ddPCR 检测方法对ddPCR 反应体系中退火温度进行优化，以确定适宜的PCR 扩增程序。以椰毒假单胞菌基因组DNA 为模板，设置退火温度在54℃、56℃、58℃、60℃和62℃ 下进行ddPCR 扩增反应。扩增完成后，将96 孔板放置到微滴检测仪中进行检测。根据扩增结果，筛选阳性微滴簇和阴性微滴簇分离明显的温度为ddPCR 检测方法的退火温度。

采用优化后的退火温度，对引物和探针浓度进行优化，确定合适的引物和探针浓度。选取引物工作浓度为0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L，探针工作浓度为0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L，进行正交实验。根据ddPCR 检测结果选取合适的引物和探针浓度。

ddPCR 反应采用20 μL 体系，包括ddPCR 预混液（10 μL），上、下游引物（2.4 μL，工作浓度为0.6 μmol/L），探针（0.6 μL，工作浓度为0.3 μmol/L），DNA 模板（5 μL），去离子水补足20 μL。将20 μL反应体系和60 μL 微滴生成油分别加入到微滴发生卡对应的孔中，通过微滴生成仪生成油包水的微滴。将生成的微滴转移至96 孔板后封膜，将封好的96孔板置于PCR 仪进行扩增反应，PCR 扩增程序为：预变性95℃ 10 min；变性94℃ 30 s，退火加延伸56℃ 1 min，40 个循环；热失活98℃ 10min。扩增完成后，将96 孔板置于微滴读取仪进行检测，进一步读取结果并分析。ddPCR 检测结果与对应的菌悬液浓度的换算公式如下：

上式中：C为对应的菌悬液浓度（CFU/mL）；c1为核酸拷贝数浓度（copies/μL）；n为反应体系中DNA 模板稀释倍数；v1为提取核酸的最终洗脱体积（μL）；v2为提取的菌悬液体积（mL）。

1.2.5 ddPCR 检测方法的特异性验证由于在椰毒假单胞菌中毒事件源头查找过程中，易与黄曲霉、枯草芽孢杆菌等常见食源性致病菌混淆，黑龙江“酸汤子”食物中毒事件就曾被误认为是“黄曲霉毒素中毒”［24］。为验证所建立的ddPCR 检测方法的特异性，将提取的椰毒假单胞菌基因组DNA 作为阳性对照，选取黄曲霉、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌等7 种食源性致病菌（表1）提取的基因组DNA 作为模板，采用1.2.1 节中设计的引物和探针，按照1.2.4 节中的方法进行检测。

1.2.6 qPCR 检测方法 qPCR 反应体系包括：qPCR预混液（12.5 μL），上、下游引物（1.5 μL，工作浓度为0.6 μmol/L），探针（0.75 μL，工作浓度为0.3 μmol/L），待测DNA 模板（5 μL），去离子水补足25 μL。置于LightCycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR 仪中进行扩增，扩增条件为：预变性95℃ 10 min；变性94℃ 30 s，退火加延伸56℃ 1 min，40 个循环。取已知拷贝数浓度的椰毒假单胞菌基因组DNA 作为标准品，绘制标准曲线。根据回归方程和Ct 值计算未知样品的拷贝数浓度。

1.2.7 人工污染糯米汤样品的检测糯米汤易被椰毒假单胞菌污染，导致中毒事件的发生，选择糯米汤作为食品基质。对椰毒假单胞菌原菌液进行10 倍梯度稀释并进行平板计数，同时取104、105、106、107稀释度菌液各5 mL 分别添加到5 mL 糯米汤中，每个稀释度设置3 个重复，制成含有不同椰毒假单胞菌添加水平的污染样品。另取5 mL PBS 加入5 mL 糯米汤中作为阴性对照。对不同添加水平的人工污染样品分别梯度稀释，进行平板计数。用细菌基因组试剂盒（天根，货号：A1120）对不同添加水平的椰毒假单胞菌污染糯米汤样品进行提取，同时进行ddPCR 和qPCR 检测。

1.2.8 人工污染糯米汤样品中ddPCR 检测方法特异性的验证在核酸水平特异性验证的基础上，为验证实际样品中所建立ddPCR 检测方法的特异性，采用椰毒假单胞菌与金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺氏菌等7 种食源致病菌同时污染糯米汤样品，在4 mL糯米汤样品中，加入椰毒假单胞菌的浓度梯度为（3×102-3×105）CFU/mL，其他7 种食源致病菌的浓度为6×105CFU/mL。混合均匀后用细菌基因组试剂盒（天根，货号：A1120）进行提取，并进行ddPCR 检测。

2 结果

2.1 ddPCR检测方法体系优化结果

为优化ddPCR 检测方法的退火温度，将退火温度分别设置为54℃、56℃、58℃、60℃和62℃进行扩增。结果如图1-A 所示，当退火温度为56℃时，阳性微滴簇与阴性微滴簇区分明显，且各微滴簇较为集中，选择56℃为椰毒假单胞菌ddPCR 检测的退火温度。优化引物和探针的正交实验结果见图1-B，引物和探针的工作浓度分别为0.6 μmol/L 与0.3 μmol/L 时，阳性微滴簇和阴性微滴簇区分最为明显，且微滴簇之间弥散微滴较少，确定该浓度为后续实验中的工作浓度。

图1 ddPCR 方法的退火温度（A）、引物和探针浓度（B）优化Fig.1 Optimization of annealing temperature（A），concentration of primer and probe（B）of ddPCR

2.2 ddPCR检测方法具有良好的特异性

由于黄曲霉与椰毒假单胞菌均易污染发酵玉米面等食品，在检测过程中可能发生混淆，因此选取黄曲霉作为对照菌株。此外，还选取了金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和沙门氏菌等6 种常见的食源性致病菌（表1），验证所建立的ddPCR 检测方法的特异性。以表1中菌株的基因组DNA 作为模板进行ddPCR 检测。结果如图2所示，只有椰毒假单胞菌基因组DNA 被检测出阳性微滴信号，而其它7 种菌株基因组DNA 检测结果均呈阴性，表明设计的引物和探针具有良好的特异性。可避免食物中毒事件追查病原菌的过程中多种致病菌的干扰，有利于椰毒假单胞菌的准确检出。

图2 椰毒假单胞菌ddPCR 检测方法的特异性结果Fig.2 Specificity of ddPCR for Pseudomonas cocovenenans

2.3 椰毒假单胞菌菌液ddPCR与qPCR、平板计数检测结果的比较

ddPCR 在102稀释度时，阳性微滴的比率为100%，不满足泊松分布，超出ddPCR 的定量范围。菌液在（1.53×103-4.13×105）CFU/mL 浓度范围内，ddPCR 检测结果相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）均小于6%，说明该方法具有较好的重复性。针对3.25×102CFU/mL（107稀释度）菌液进行重复检测，RSD 值为16.29%，此时ddPCR检测读数结果为1.38 copies/μL，若浓度更低则无法检出。ddPCR 方法的检出限为3.25×102CFU/mL（表3）。

如表4所示，根据标准曲线和Ct 值计算出的各稀释度菌液浓度。在（5.42×103-2.75×108）CFU/mL 范围内，qPCR 检测结果的RSD 值均小于6%，说明该方法重复性好。qPCR 在106稀释度时已超出其检测范围（Ct ≥ 35），检出限为5.42×103CFU/mL。相比于ddPCR 方法，qPCR 方法的检出限更高，然而该方法可检测到2.75×108CFU/mL 的高浓度菌液，具有更广泛的检测范围。

为比较3 种检测方法的检出限和灵敏度，根据平板计数法，椰毒假单胞菌原菌液浓度为1.02×109CFU/mL；qPCR 方法在有效检测范围内，由各稀释度计算出的原菌液浓度的平均值为1.1×109CFU/mL；ddPCR 方法计算出的原菌液浓度为1.2×109CFU/mL。ddPCR 检测结果比平板计数结果高18%，这可能是由于部分细菌处于存活非可培养状态（viable but non-culturabe，VBNC），该状态通过平板培养方法无法形成菌落，核酸检测可检出VBNC 状态的细菌，导致平板计数结果偏低［25-27］。如图3所示，线段的起止代表不同方法的检测范围，当菌液稀释度低于103（浓度高于4.13×105CFU/mL）时，超出ddPCR 方法的定量范围，仍可通过qPCR 方法进行定量检测。ddPCR 方法的检出限（3.25×102CFU/mL）低于qPCR 方法（5.42×103CFU/mL）。两种方法在其检测范围内均具有较好的重复性，ddPCR 方法具有更高的灵敏度，qPCR 方法对于高浓度的菌液，具有更广泛的检测范围。

图3 三种检测方法对不同浓度椰毒假单胞菌检测结果Fig.3 Different concentration results of P.cocovenenans by 3 detection methods

2.4 人工污染糯米汤样品的检测结果

取104-107稀释度椰毒假单胞菌菌液添加到糯米汤中，根据添加菌液的平板计数结果，人工污染糯米汤样品中椰毒假单胞菌的添加量为（3.4×102-3.4×105）CFU/mL。对不同添加量的人工污染糯米汤样品同时进行ddPCR 和qPCR 检测以及平板计数，结果如图4所示。ddPCR 对107稀释度菌液添加水平仍能检出，qPCR 不能检出，ddPCR 具有更高的灵敏度，对人工污染糯米汤样品的检出限为361 CFU/mL。在各添加水平菌液污染糯米汤样品的检测结果中，ddPCR 检测结果的RSD 值均小于平板计数结果的RSD 值，具有更好的重复性。此外，从细菌基因组提取到ddPCR 检测可在4 h 内完成，平板计数法检测时间需包含细菌菌落生长的时间，需要至少18 h。与平板计数法相比，ddPCR 检测方法明显缩短了检测时间，有利于食物中毒的快速检测分析，从而提高相关诊断治疗的科学性。

图4 人工污染样品中椰毒假单胞菌的定量检测结果Fig.4 Quantitative results of Pseudomonas cocovenenans in artificially contaminated samples

2.5 人工污染糯米汤样品中ddPCR 检测方法的特异性验证结果

2.2 的结果表明建立的ddPCR 检测方法在核酸水平具有较好的特异性。制备椰毒假单胞菌和金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺氏菌等7 种食源致病菌同时污染的糯米汤样品，对该方法在实际样品中检测的特异性进行验证。在人工污染糯米汤样品中加入的椰毒假单胞菌浓度为（3×102-3×105）CFU/mL，金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺氏菌等7 种食源致病菌的浓度为6×105CFU/mL。对单一（椰毒假单胞菌）和多种食源性致病菌污染的糯米汤样品进行ddPCR检测并比较其定量结果。结果如图5所示，在椰毒假单胞菌不同水平的污染糯米汤样品中，添加较高浓度的金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺氏菌等7 种食源致病菌，对于椰毒假单胞菌的定量结果没有影响。表明建立的ddPCR 检测方法在实际样品检测过程中具有较强的抗干扰能力，表现出较好的特异性。

图5 人工污染样品中椰毒假单胞菌ddPCR 检测方法的特异性验证结果Fig.5 Specificity verification of ddPCR method for the detection of P.cocovenenans in artificially contaminated samples

3 讨论

2020年10月黑龙江省鸡西市发生“酸汤子”食物中毒事件，9 名食用者全部死亡。经流行病学调查与采样检测，在患者胃液及其食用的玉米面中检出细菌毒素米酵菌酸，证实此次食物中毒事件是由椰毒假单胞菌污染产生的米酵菌酸所致［28］。椰毒假单胞菌引起食物中毒的潜伏期是4 h-6 h，初始中毒症状包括腹痛、全身无力、大量出汗、疲倦和嗜睡以及昏迷，在初始症状发作后 2 h-24 h 内导致死亡［29］。椰毒假单胞菌污染食品的可能途径很多，如原材料污染、工厂生产过程污染等［30-31］。同时，该菌温度适应范围广，在26℃-37℃范围内均可生长，低温下也可存活，食物储存方式不当可能导致椰毒假单胞菌污染，其产生米酵菌酸毒素，对肝脏和肾脏等器官造成严重损伤，目前仍缺乏特效解毒药物［3，32］。本研究针对椰毒假单胞菌高度保守的16S-23S rRNA 序列，优化并建立了基于数字PCR技术的定量检测方法。现行国家标准GB4789.29-2020 采用平板培养结合毒理学实验对椰毒假单胞菌进行检测［33］，样品经GVC 选择性增菌液分离椰毒假单胞菌，该增菌液添加了龙胆紫抑制革兰氏阳性菌及氯霉素抑制其他多种革兰氏阴性菌，再利用选择性培养基进行平板培养。平板培养耗时较长，不利于食物中毒事件中快速确定致病菌并进行治疗。已有研究表明：细菌在低温、紫外线等胁迫条件下可能进入存活非可培养（VBNC）状态，VBNC 状态的细菌仍具有代谢活性，但通过平板培养不能形成菌落［24，34］，因此可能导致平板计数法检测结果偏低。与平板计数法相比，数字PCR 方法可避免检测过程中细菌VBNC 状态的影响。该方法将检测时间由18 h 以上缩短至4 h 以内，其检测结果的RSD 小于平板计数法，显著提高了检测结果的准确性与重复性。

基于PCR 扩增技术，已有研究人员建立了环介导等温扩增法、荧光定量PCR 法并用于椰毒假单胞菌的检测，但是环介导等温扩增法只能实现定性分析，荧光定量PCR 法依赖标准曲线进行相对定量检测［15-16］。目前尚无针对椰毒假单胞菌的绝对定量检测方法，本研究采用的数字PCR 方法不依赖于标准曲线，可以实现核酸分子的绝对定量。该方法通过将DNA 分子无限稀释，使每个反应单元中包含至少一个拷贝的核酸分子，经过PCR 扩增，通过统计阳性反应的单元数结合泊松分布的原理计算目标核酸的拷贝数，实现绝对定量检测。本研究利用数字PCR 技术，通过对反应体系的优化，建立了针对椰毒假单胞菌核酸的绝对定量方法。在与其他常见食源性致病菌共同污染样品的检测过程中，该方法表现出良好的特异性。针对含不同菌液浓度的人工污染糯米汤样品，该方法的检出限为361 CFU/mL，而对于该浓度的人工污染样品，qPCR 方法不能检出，因此数字PCR 方法具有更高的灵敏度。本研究建立的数字PCR 方法具有特异性强、灵敏度高和检测快速等特点，能够为椰毒假单胞菌的快速准确检测提供参考，有助于预防中毒事件的发生。