基于微流控与喷墨打印技术的微液滴形成芯片

单子龙, 祝明杰, 宁 伟, 吴炫烨

(1.上海大学 微电子学院，上海 200000； 2．上海微技术工业研究院，上海 200000)

0 引 言

近年来，随着微流控芯片的发展，微流控液滴技术逐步走进人们的视野，其为一种研究尺寸可以小至120 μm的微液滴的生成、操控及应用的新技术[1,2]。互不相容的2种液体分别作为连续相和分散相，通过微流控法使分散相液体分散在连续相液体中形成液滴[3]。微液滴常作为微反应单元，能够完成生化反应、试剂快速融合等功能，对微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点起到了大大的增强作用。随着微流控与MEMS技术的不断发展，微流控液滴技术在生物工程、化学分析、疾病防护、细胞研究、药物传输和材料合成等众多领域得到了广泛应用[4～7]，并发挥着重要作用。

目前,有很多微液滴的制备方法，主要有膜乳化法[8,9]、逐层沉积法[10]、高速搅拌法[11]、界面聚合法[12]等，这些传统的制备方法通常需要特定的乳液合成配方和多步骤处理，并且对复杂结构的微液滴的各部分无法进行精确调控。此外，由于传统合成工艺的自身局限性，造成了剪切力的可变性高，形成的微液滴尺寸和形态有很大差异。现在主流的液滴生成方法是微流控法。微流控芯片作为生成液滴的主要载体，具有体系封闭、生成液滴速度快，体积小等优势。

本文主要研究一种新的微流控法制备微液滴，采用微流控芯片与MEMS半导体技术结合的方法制备微液滴，符合当今生物化学分析处于微型化和集成化的发展潮流。本文系统研究了喷孔位置、分散相黏度、分散相与MEMS半导体芯片的接触角等因素对液滴生成的影响，形成了能够生成尺寸稳定，数量多，体积小至皮升(pL)级液滴的新型液滴生成方法，该方法能够为数字聚合酶链式反应(PCR)提供一个新的平台。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Rushmore MEMS半导体芯片(上海微技术工业研究院)；T100 Thermal Cycler PCR仪(美国伯乐Bio-Rad公司)；LS-dPCR数字PCR阅片仪(北京凌云光技术集团有限责任公司)；LAS 60接触角测量仪(德国劳达)。

液滴生成试剂和液滴生成油(美国Bio-Rad公司)；甘油(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)(上海泰坦科技股份有限公司)；明胶(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；酒精(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；海藻糖(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；实验室使用水为去离子水(细胞培养级)。

1.2 微流控芯片设计与制备

1.2.1 设计原理

本文采用的主要是热发泡喷墨打印技术，其原理如图1所示。装置主要分为薄膜加热电阻，喷嘴(吸取水相)，油相储存区3部分(图1(a))。加热电阻能够瞬间将水相喷出区域中的水相加热至300 ℃以上，形成无数微小气泡(图1(b))；气泡以极快的速度聚集成为大气泡并扩展，迫使喷嘴中的水相从喷嘴中喷出进入油相形成油包水微液滴(图1(c))；气泡再继续成长几秒后，便会消失，然后由于水相的表面张力所产生的吸力，会把新的水相拉引到水相喷出区准备下次的循环喷射(图1(d))。采用该原理可以得到体积更小，形成频率更高，数量更多的微液滴。

图1 热发泡喷墨打印原理

1.2.2 微流控芯片设计

基于设计原理进行微流控芯片的设计，结构如图2(a)所示，整体尺寸：长度为27.05 mm，宽度为17 mm，厚度为4.5 mm；孔道直径为1 mm。该芯片能够储存20 μL的试剂。沟槽结构的设计是为了涂敷胶水便于进行封装。

收集腔的整体尺寸：长度为22 mm；宽度为10 mm；厚度为3.25 mm。有2个对称分布直径为1 mm的液孔。含有2个腔室，下腔室用于储存油相和收集微液滴，下腔室不是简单的长方形槽，是为了避免微液滴积聚在角落不能够被吸出参与检测，造成结果不准确。上腔室是为了收集液孔中流出的溶液，减少微液滴的不必要损失(图2(b))。

图2 结构设计

液滴发生器功能的实现需要将半导体芯片上的加热电阻连接到控制电路上，需要与26个接口进行连接，设计出含有26个顶针孔的卡槽结构(图2(c))，液滴发生器固定在卡槽中，上面的接口要充分与顶针接触，只靠其自身重力无法实现完全的有效连接，需要一卡夹压紧液滴发生器(图2(d))，在卡夹与液滴发生器接触的地方贴上橡胶垫，使两者的接触为软接触，压得更紧更牢。卡夹与卡槽机械配合，卡夹可以转动使用，方便液滴发生器的安装和取出。整个微液滴形成装置如图2(e)所示，按照其组装，连接电源即可完成液滴生成。

本文中的液滴发生器需要一定的封装手段来完成其功能的实现。将微流控芯片、MEMS半导体芯片和收集腔封装成一个密封性良好的整体。

1.3 微型液滴制备与检测

微型液滴的形成是结合微流控与MEMS半导体技术，利用热发泡喷墨打印原理形成微液滴。微液滴的制备流程如图3(a)所示，MEMS半导体芯片有640个喷嘴用于形成微型液滴。微流控芯片和收集腔的材料选择为透明PC，因为,该材料具有良好的耐溶剂性、耐老化性、尺寸稳定性、电化学性，且强度高、蠕变性小。透光性好可以直接观察液滴的流动状况。封装好的液滴发生芯片放入控制器的卡槽中连接电路，通过软件可控制液滴的形成，可生成体积为24 pL的微型液滴。

可将该生成液滴的技术应用于数字PCR，将微型液滴作为一个反应单元，经过PCR仪扩增，将反应单元中的目的基因指数级扩增；将扩增后的液滴打进结果阅读芯片中，它的结构设计能将微型液滴平铺在其内部流道中，结果阅读芯片放入光学检测仪器中，进行微型液滴形貌与荧光信号的检测(检测过程如图3(b))。

图3 微液滴的制备流程和检测过程

2 结果与讨论

2.1 喷孔位置对微液滴形成的影响

本文所使用的MEMS半导体芯片有两排喷孔，每排喷孔数有320个，并排相邻的喷孔间隔很小(即加热电阻相距很近)。进行了喷孔总数为40个，间距为21.5，64.5，107.5 μm的实验，为了进一步分析液滴的生成状况，分别对3组不同间距得到的微液滴明场图进行图像处理，得到的结果如图4(a)，可以看出,几乎可以识别出所有微液滴，这有利于微液滴的统计。然后对图像处理的数据进行统计计算。为了比较微液滴生成状况的不同，进而引入变异系数(coefficient of variance,CV)值(微液滴尺寸标准偏差与尺寸平均数的比)进行比较。如图4(b)为不同间距下的微液滴尺寸的CV值，该系统所得到的微液滴平均尺寸在30～34 μm，从图4(b)中可以得到，喷孔间距为21.5 μm的CV值为11.7 %；间距为64.5 μm的CV值为10.00 %；间距为107.5 μm的CV值为10.80 %。

图4 图像处理与CV值折线

调整喷孔位置对均匀度有所优化，但持续的增加间隔并不能使均匀度得到进一步优化。由于该形成液滴的原理采用的是热发泡喷墨打印技术，使用间距为21.5 μm的喷孔喷射形成微液滴时，加热电阻距离近，会对相邻的喷孔产生影响，从而产生卫星液滴，使CV值变大。当使用间距更大的喷孔时，削弱了相邻加热电阻的影响，能够减少卫星液滴的产生，由于相邻加热电阻的影响并不是很强，再增加间距并不能再对液滴的形成有影响。

2.2 黏度对微液滴形成的影响

通过增加分散相中溶质的百分含量来调控黏度的大小，进行了4种不同试剂分散相的实验。如图5(a)所示，分别是增加PEG600、PEG1000、PEG8000、甘油的百分含量所对应的黏度折线图，从图中可知：随着含量的增加，黏度会逐渐升高。对不同含量的PEG600进行液滴生成，生成状况如图5(b)。0.4 % PEG600的黏度为1.28 Pa·s，平均直径为33.12 μm，CV值为10.66 %；2 % PEG600的黏度为1.40 Pa·s，平均直径为33.93 μm，CV值为12.27 %；10 % PEG600的黏度为2.29 Pa·s，平均直径为35.17 μm，CV值为14.37 %。分析可得：当黏度越大，形成的微液滴平均尺寸会越大，并且均匀度会变差。黏度大于2.5 Pa·s后，几乎无法从喷孔中喷出液滴。黏度会对气泡的产生起抑制作用，黏度越大，气泡的最大体积和持续时间越短。当黏度大于2.5 Pa·s时，加热电阻不足以产生使其喷出的力，因此无法形成液滴。

图5 黏度和CV值折线

2.3 芯片材料润湿性能对微液滴形成的影响

不同分散相与MEMS半导体芯片上干膜的接触角不同，会对固液界面相互作用的自由能有所影响，测量部分可形成微液滴的分散相与干膜的接触角(后面直接简称溶液的接触角)，通过观察液滴形成的状况，来判断其对微液滴形成的影响。由于每次接触角的测量会受各种条件的影响，采用几乎不会变化的去离子水作为参照物，每次先进行去离子水与干膜的接触角的测量(图6(a))。对实验中常用的几种试剂的接触角进行了测量(图6(b))，发现：水凝胶的接触角与去离子水相差10.13°，形成微液滴的效果最好， PEG的接触角与去离子水相差更小，海藻糖溶液的接触角与去离子水相差更大，他们形成的液滴相对较差。为了进一步分析4种试剂形成微液滴的状况，进行了液滴尺寸的统计计算(如图6(c))，分别为美国Bio-Rad公司丙烯酰胺溶液、PEG溶液、海藻糖溶液、明胶(GM)溶液。从数据可以明显看出,水凝胶溶液的CV值为5.57，液滴大小的均匀度远远好于其他3种溶液(分别为11.77 %，10.66 %，11.39 %)。

图6 4种试剂形成微液滴的状况

为了进一步探讨接触角对微液滴形成的影响，测量了不同试剂、不同含量与干膜的接触角(图7(a))。从图7(b)中可以看出：与去离子水接触角相差-5～12°范围内形成液滴最好；-15～-5°形成的液滴含有很多卫星液滴；大于12°和小于-15°形成的液滴会出现很多大液滴包含小液滴的现象。

图7 接触角对微液滴形成的影响

3 结 论

综上所述，开发了一种新型的液滴生成方式，克服了现有液滴生成方式产生液滴不稳定，且液滴量比较少等难题，能够产生尺寸稳定，数量多，体积小至皮升级的液滴，将该技术应用于数字PCR能够大大的提高其灵敏度。本文探讨了影响微液滴的几种因素，通过控制喷孔位置、分散相的黏度以及其与MEMS半导体上干膜的接触角大小，可以获得大量的CV值低于6 %的微液滴。这种液滴生成方式在数字PCR技术有巨大的应用潜力，能够在短时间内产生大量的微型液滴，并且密封良好，能够有效避免数字PCR试剂的污染，对于液滴数字PCR是个全新的，更好的平台，而且能够为小型一体化数字PCR仪的研究提供可能。