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结核分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的制备、纯化及鉴定*

2023-02-02杨雨欣万巧凤

科技与创新 2023年2期
关键词:真核病原学滴度

李 慧,姚 思,杨雨欣,张 炜,万巧凤

(1.宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系,宁夏 银川 750004;2.宁夏医科大学临床医学院,宁夏 银川 750004)

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,以下简称“M.tb”)感染所致的一种慢性传染病,是世界3大传染性疾病之一。《2021年全球结核病报告》数据显示,中国2020年结核病新发患者数为84.2万,发病率约为0.059%,在全球30个结核病高负担国家中,中国高居第二[1],因此防治该病极其重要。

M.tb的分泌性蛋白是诱导宿主发挥免疫效应的靶标,也是开发疫苗或诊断试剂的潜在分子[2]。Ag85复合物是M.tb的分泌蛋白,占M.tb分泌蛋白总量的45%,该复合物包括Ag85A、Ag85B和Ag85C这3种组分,其中Ag85B占22%[3]。Ag85B是由M.tb的Rv1886c基因编码的早期分泌性蛋白,其能够诱导机体产生较强的T细胞和B细胞免疫反应[4]。由此可见,Ag85B可作为良好的免疫原及TB早期诊断的潜在分子。本研究采用微针注射法将Ag85B真核表达质粒pcD-Ag85B经大腿肌肉免疫SD大鼠,诱导产生Anti-Ag85B多克隆抗体,旨在为进一步研究Ag85的功能及早期诊断结核病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验室成功构建了真核表达质粒pcD-Ag85B[5]。Protein G购自上海翊圣生物科技有限公司,硫酸卡那霉素、ⅠPTG、琼脂糖、胰化蛋白胨及酵母提取物均购自宁夏科博生物科技有限公司,质粒无内毒素大量提取试剂盒购自Omega Bio-Tek,鼠抗Ag85B单抗购自北京博奥森生物技术有限公司,蛋白marker购自北京全式金生物技术有限公司,HRP标记的羊抗鼠ⅠgG二抗购自美国Merck公司,其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 实验动物

实验动物为SPF级6~7周龄、体重(180±20)g的SD雄性大鼠6只,购自宁夏医科大学实验动物中心(合格证书编号为SCXK(宁)2022-0001)。

1.2.2 多克隆抗体制备及滴度测定

适应性饲养SD鼠3 d后,采用微针经大腿肌肉注射法免疫(200 μg/只),每周免疫1次,连续免疫3次。首次免疫后的14 d、28 d、42 d,尾端采血且分离血清。采用间接ELⅠSA法将纯化的Ag85B蛋白配制成10 μg/mL的溶液包被96孔酶标板,0.1 mL/孔,4℃过夜;加入2%BSA封闭液0.1 mL/孔,37℃静置2 h;TBST洗板4次,加入2倍稀释(体积分数分别为0.05%、0.025%、0.012 5%、0.006 25%、0.003 125%、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240)的免疫血清,第一列设为PBS阴性对照,37℃精心孵育l h。

加入HRP标记的羊抗鼠ⅠgG(1∶1 000),0.1mL/孔,37℃温育40 min;PBST洗板,加入底物,0.1 mL/孔,37℃避光孵育15 min后终止反应,用酶标仪测得OD值为450 nm。实验孔OD值/阴性对照OD值大于2.1倍的最高样品稀释度为抗体的滴度[6]。

1.2.3多克隆抗体的纯化

采用pH为7.4的PBS缓冲液稀释血清样品,经滤膜除去血清中的细胞残渣及小颗粒物质。将样品注入预先平衡好的装有Protein G填料的结合柱,结合2 h后用5倍柱体积PB S洗涤杂质。用洗脱缓冲液(0.1 mol/L的Gly,pH为3)进行洗脱,再用1 mol/L的Tris-HC(pH为8.5)将抗体pH调至中性,最后用浓缩管浓缩抗体,定量后在-80℃温度中保存。

1.2.4 WB检测Anti-Ag85B抗体与Ag85B特异性结合情况

取20 μg的Ag85B蛋白,加5×SDS上样缓冲液混匀,水浴煮沸5 min,经12%的SDS-PAGE分离后,半干电转膜仪转移至PVDF膜上,以5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST洗膜3次,加一抗(纯化后的Anti-Ag85B抗体,按1∶1 000稀释)室温下孵育1 h,再用TBST缓冲液洗膜3次。加入HRP标记的兔抗鼠ⅠgG(1∶2 000),37℃振荡60 min;加入ECL发光液,进行显影、定影操作。

2 结果

2.1 Ag85B蛋白对血清IgG及抗体滴度的影响

抗体滴度的检测如图1所示。间接ELⅠSA结果显示,一免后第14 d,在免疫组小鼠的血清中检测到特异性ⅠgG,抗体平均滴度为1∶747;第28 d抗体平均滴度为1∶2 240;第42 d抗体平均滴度为1∶2 667。结果表明,pcD-Ag85B质粒可持续诱导体液免疫。

图1 抗体滴度的检测( ±s,n=6)

2.2 Anti-Ag85B多克隆抗体的纯化

SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化前后的Anti-Ag85B多克隆抗体如图2所示。SDS-PAGE凝胶电泳结果表明,Ag85B抗血清纯化前非特异性杂带较多,采用Protein G亲和层析柱纯化后,多数非特异性抗体被去除,获得了纯度较高的Anti-Ag85B抗体。

图2 SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化前后的Anti-Ag85B多克隆抗体

2.3 WB分析多克隆抗体的特异性

WB检测Protein G纯化后抗体的特异性如图3所示。纯化后的抗血清可与前期[6]制备的Ag85B蛋白特异性结合,在相对分子质量35 kD处出现一条清晰的条带,且无其他杂带,说明制备的多隆抗体特异性良好。

图3 Western blot检测纯化后的Anti-Ag85B多克隆抗体与Ag85B蛋白的特异性结合

3 讨论

目前,用于诊断TB的方法有X光、病原学检测法、结核菌素PPD皮肤试验及TB特异核酸序列扩增法等。其中病原学检测是诊断TB的金标准,中国的M.tb病原学诊断率较低,2020年WHO报告显示,中国TB病原学阳性率为47%,低于全世界57%的检出率,仅靠此法会延误对患者的治疗[7];PPD皮试具有操作简单的优势,但难以区分卡介苗的免疫效果及致病性M.tb的感染,因此诊断价值不高[8];在TB早期诊断中,核酸扩增法是病原学诊断的重要补充,但因其成本高及对检测环境要求严格限制了其在基层医院的普及[9]。血清学检测具有操作简便、灵敏度高、适用于肺外结核和肺结核等优势[10],所以筛选灵敏度高、特异性强的M.tb抗原或抗体,并将其应用于TB的早期血清学检测中,是诊断TB的理想方法。

真核表达质粒将是一种抗原基因重组到真核表达载体,直接或经包装注入体内表达出相应抗原蛋白,此蛋白能刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫效应,从而发挥免疫保护作用[11]。真核表达质粒具有制备简便、成本低廉、稳定性及安全性好的优势,越来越受到人们的重视[12]。

本研究采用微针注射法将前期构建成功,且证明体外表达的Ag85B真核表达质粒pcD-Ag85B经大腿肌肉免疫SD大鼠,诱导产生并获得了纯度高、特异性强的多克隆抗体,为进一步研究Ag85的功能及诊断结核病奠定了基础。

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