LncRNA MCF2L-AS1靶向调控miR-138-5p对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

徐梅玲 张育珠 申大年

(1青海省第五人民医院疼痛科，青海 西宁 810007；2西宁市第一人民医院疼痛科；3青海省第五人民医院泌尿科)

骨质疏松(OP)以骨量减少、骨组织结构改变为特征，随着社会老龄化的发展，患有OP病例逐渐升高，加重了患者家人及社会的负担〔1〕。成骨细胞是骨重建中维持骨量的主要细胞之一，是骨形成过程中的重要功能细胞，其来源于骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化失衡是引发OP的关键〔2,3〕。研究表明长链非编码RNA(lncRNA)广泛参与BMSCs成骨分化进程，调节干细胞及成骨细胞的增殖与凋亡，在干细胞的多能分化及骨科相关疾病的发生发展起重要的调控作用〔4〕。MCF2L可增加滑膜成纤维细胞凋亡及诱导炎症反应从而促进骨关节炎的发生〔5〕。MCF2L的反义RNA1(MCF2L-AS1)是一种lncRNA，研究报道MCF2L-AS1通过使miR-33a海绵化而积极调节Runx2的表达，可促进BMSCs的成骨分化〔6〕。但MCF2L-AS1对BMSCs分子机制尚不清楚。研究显示，MSCs诱导分化为汗腺样细胞过程中has-miR-138-5p减少〔7〕。高脂环境下BMSCs向成骨细胞分化减少，miR-138-5p参与调控高脂环境下骨代谢和成骨细胞的生物学活性〔8〕。本实验旨在研究MCF2L-AS1可能通过靶向调控miR-138-5p对BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1组织来源 收集手术切除的正常骨组织和OP患者的疏松骨组织各25例。所选病例资料完整，无代谢性相关疾病病史及慢性用药史。

1.2细胞与主要药品 hBMSCs购自广州赛莱拉干细胞科技公司；成骨分化培养基购自德国PromoCell公司；人BMSCs(hBMSCs)完全培养基购自武汉益普生物；荧光定量试剂盒购自日本Takara公司；蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自北京百奥莱博；CCK-8、凋亡试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒购自北京索莱宝。

1.3细胞培养 将hBMSCs接种于hBMSCs完全培养基中，在37℃水浴中进行复苏；取对数生长期hBMSCs，将其接种于成骨分化培养基中在37℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液1次，分别收集第0、1、3、7、14天培养细胞备用。

1.4细胞转染与分组 将si-NC、si-MCF2L-AS1、miR-NC、miR-138-5p、pcDNA-NC、pcDNA-MCF2L-AS1转染至hBMSCs中，记为si-MCF2L-AS1组、si-NC组、miR-138-5p组、miR-NC组、pcDNA-MCF2L-AS1组、pcDNA-NC组；将si-MCF2L-AS1分别与anti-miR-NC、anti-miR-138-5p共转染，记为si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC组和si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p组。

1.5实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、ALP、RUNX2、OCN表达水平 提取正常骨组织、OP患者骨组织、诱导分化0、1、3、7、14 d的hBMSCs及各组细胞的总RNA，合成cDNA，按荧光定量试剂盒进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为作为内参，MCF2L-AS1上游引物：5′-TCCAGCTCGTGTCTATG-CAG-3′，下游：5′-CTGCTTCTGCCTCAG-CTTCT-3′；miR-138-5p上游引物：5′-TGCGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3′，下游：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；ALP上游引物：5′-GCCATTGGCACCTGCCTTAC-3′，下游：5′-AGCTCCAGGCATATTTCAGTGTC-3′；RunX2上游引物：5′-CCGGTCTCCTTCCAGGAT-3′，下游：5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′；OCN上游引物：5′-ACCCTCTCTCTGCTCACTCTGCT-3′，下游：5′-GCTGGGGCTCCAAGTCCATT-3′。

1.6Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3蛋白表达 提取细胞总蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜、封闭后，加一抗4℃孵育过夜，加二抗室温孵育90 min，显影、成像，检测蛋白条带的灰度值。

1.7CCK-8检测细胞增殖率 细胞培养48 h，每孔加10 μl CCK-8试剂，孵育2 h，酶标仪检测490 nm处吸光度值(A)。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡率 细胞培养48 h，加膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)混匀，避光孵育10 min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9荧光素酶报告实验检测LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的靶向关系 构建含有miR-138-5p结合位点的LncRNA MCF2L-AS1野生型及突变型报告基因载体，hBMSCs细胞转染miR-NC、miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1野生型及突变型载体，按说明书检测荧光素酶活性。

1.10统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p在OP的表达水平 OP骨组织中LncRNA MCF2L-AS1表达水平明显低于正常骨组织，miR-138-5p表达水平明显高于正常骨组织(均P<0.001)，见表1。

表1 OP患者中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表达水平

2.2在hBMSCs分化培养中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表达水平 与0 d相比，在hBMSCs分化培养1、3、7、14 d时LncRNA MCF2L-AS1表达、ALP、RUNX2、OCN表达水平明显升高，miR-138-5p表达水平明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 在hBMSCs分化培养中LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p及成骨分化相关因子的表达水平

2.3低表达LncRNA MCF2L-AS1对hBMSCs细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响 与si-NC组相比，si-MCF2L-AS1组Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率明显升高，LncRNA MCF2L-AS1表达、ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表达水平、细胞增殖率明显降低(P<0.05)，见图1、图2、表3。

图1 低表达LncRNA MCF2L-AS1对hBMSCs细胞凋亡的影响

图2 Western印迹检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表3 低表达LncRNA MCF2L-AS1对hBMSCs细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

2.4高表达miR-138-5p对hBMSCs细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响 与miR-NC组相比，miR-138-5p组miR-138-5p表达水平、Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率明显升高，ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表达水平、细胞增殖率明显降低(P<0.05)，见表4、图3。

表4 高表达miR-138-5p对hBMSCs细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

图3 高表达miR-138-5p对hBMSCs细胞增殖、凋亡相关蛋白的影响

2.5LncRNA MCF2L-AS1靶向miR-138-5p 图4显示MCF2L-AS1与miR-138-5p存在结合位点。与miR-NC组比较，miR-138-5p降低WT荧光素酶活性(P<0.001)；对MUT荧光素酶活性无显著差异，见表5。pcDNA-MCF2L-AS1组miR-138-5p表达水平(0.43±0.04)明显低于pcDNA-NC组(1.00±0.08，P<0.05)，si-MCF2L-AS1组miR-138-5p表达水平(1.73±0.11)明显高于si-NC组(0.98±0.09，P<0.05)。

表5 双荧光素报告实验

图4 miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1结合位点

2.6低表达miR-138-5p部分逆转MCF2L-AS1低表达对hBMSCs细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响 si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p组miR-138-5p表达水平、Cleaved-caspase-3表达水平、细胞凋亡率明显低于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC组，ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表达水平、细胞增殖率明显高于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC组(P<0.05)，见表6、图5。

表6 低表达miR-138-5p 可以部分逆转MCF2L-AS1低表达对hBMSCs细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

1～2：si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC组，si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p组图5 低表达miR-138-5p 和MCF2L-AS1对hBMSCs细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达

3 讨 论

OP患者BMSCs成骨分化能力减弱，因此增强BMSCs的成骨分化能力及促进BMSCs增殖、抑制凋亡是防治OP的重要途径之一〔9〕。研究报道LncRNA影响BMSCs的成骨分化进而影响骨代谢进程〔10〕。且已有研究表明LncRNA MCF2L-AS1参与BMSCs的成骨分化〔6〕。本研究结果表明，LncRNA MCF2L-AS1的确参与了BMSCs的成骨分化过程，且与OP的发生发展可能有关。本实验显示，ALP、RunX2、OCN表达水平降低，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高。

ALP、RUNX2、OCN均是成骨分化相关因子，ALP是骨组织分解代谢的一种酶，与钙化有关，可反映成骨细胞分化及功能状态〔11〕。RUNX2是成骨细胞分化及骨形成的重要转录因子，RUNX2能调控间质细胞向前成骨细胞分化〔12〕。OCN由成熟骨细胞分泌，是骨细胞成熟标志〔13〕。本实验结果表明，低表达LncRNA MCF2L-AS1可抑制hBMSCs增殖促进细胞、凋亡及抑制成骨分化。

研究报道在力学去负荷条件下miR-138-5p表达水平明显升高，成骨细胞分化能力降低；而 抑制miR-138-5p能有效地逆转力学去负荷对成骨细胞分化的抑制作用〔14〕。非病毒寡核苷酸抗miR-138传递至间充质干细胞可显著增强BMSC片的体外成骨分化，上调成骨相关基因RUNX2、ALP、OCN和骨形态发生蛋白(BMP)2表达〔15〕。miR-138可抑制人去分化软骨细胞的成骨分化和矿化作用〔16〕，表明miR-138-5p参与成骨分化。本实验结果与上述研究结果相符。还有研究报道LOC103691336竞争结合miR-138-5p从而上调BMPR2的表达促进镁介导的成骨分化〔17〕。本实验提示，MCF2L-AS1可能通过调控miR-138-5p影响hBMSCs增殖、凋亡和成骨分化。

综上，低表达LncRNA MCF2L-AS1通过调控miR-138-5p抑制hBMSCs增殖和成骨分化，促进细胞凋亡。低表达LncRNA MCF2L-AS1可能抑制hBMSCs成骨分化影响OP的发展。