B族链球菌不同检测方法的效果评价

周新荣，范世珍，于波海，马 正，莫 莉

(广州中医药大学深圳医院(福田)，广东 深圳518034)

B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，又称无乳链球菌，革兰阳性球菌，常寄生于阴道和直肠，为兼性厌氧的条件致病菌，是引起新生儿败血症和脑膜炎等侵袭感染的首要致病菌[1]。妊娠期可引发晚期流产、胎儿生长受限、胎膜早破、早产等不良妊娠结局[2]。GBS严重感染导致胎儿、新生儿死亡的病例也有所报道[1]。2010年美国CDC指南推荐，无论早发型GBS危险因素是否存在，所有孕妇都应进行GBS筛查[3]，这在很大程度上减少了围产期GBS感染的危害尤其是早产型GBS感染。国内2018年发布的《孕前和孕期保健指南》将孕晚期35-37周孕妇GBS筛查作为产前检查的备查项目[4]。对围产期孕妇进行GBS筛查，是预防新生儿GBS感染的最有效手段[5]。

GBS筛查的标准方法为细菌培养鉴定方法，但该方法假阴性率高，容易造成漏诊[6]。随着分子生物学的发展，近年来出现了许多操作简便、敏感度高、检测时间短、结果判断简单或能自动化判读的新检测方法，如特异性抗原或抗体测定、核酸探针检测、聚合酶链式反应(PCR)等。由于GBS检测方法、诊断标准的不统一，受年龄和地区等因素的影响，围产期GBS感染率差异较大[7]。我国目前还没有形成GBS筛查及防治的统一方法。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测微生物技术是近年来发展起来的鉴定病原微生物的新技术，可通过对供试病原微生物的生物活性分子的指纹图谱进行同源分析而快速鉴定菌种，对疾病诊断具有重要意义[8]。MALDI-TOF-MS在临床微生物实验室，主要应用于微生物单个菌落的鉴定，并逐渐取代生化和其他表型分析方法[9]。与传统病原微生物鉴定方法相比，MALDI-TOF-MS技术具有灵敏度较高、准确率较高、耗能较低、高通量等优点[10]。近年来有研究报道MALDI-TOF-MS在阳性血培养瓶、尿标本[11]微生物快速鉴定中的临床应用，均具有较好的临床应用价值，能够准确、快速对液体标本中的微生物进行鉴定，可以弥补传统培养方法的不足，有效缩短检验时间，准确快速地为临床提供检验结果。

基于上述研究基础以及MALDI-TOFMS鉴定微生物的显著优势，本研究拟采用国产Clin-ToF微生物处理试剂联合MALDI-TOFMS方法直接鉴定培养后样本中的B族链球菌，评价该国产化微生物处理试剂的效果，旨在提供一种可选择的B族链球菌灵敏快速检测方法，以降低B族链球菌鉴定的时间成本。此外本研究同时采用质谱快速鉴定法、选择肉汤培养后涂平板法、细菌培养法、实时荧光PCR法和胶体金免疫层析法进行GBS筛查实验，旨在分析质谱快速鉴定法、选择肉汤培养后涂平板法、实时荧光PCR法和胶体金免疫层析法在孕妇B群链球菌(GBS)定植筛查中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 菌株

1.1.1临床菌株 278株GBS临床菌株分离自2019年8月至2020年9月在广州中医药大学深圳医院产科门诊自愿接受产前GBS筛查的孕妇(孕35-37周)。孕妇在标本采集前2周无性交且未接受抗菌药物治疗。

1.1.2质控菌株 无乳链球菌(ATCC12386)、大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)。

1.2 仪器与试剂Clin-ToF II飞行时间质谱系统(北京毅新博创生物科技有限公司)、QuantStudio Dx(美国ABI)、B族链球菌核酸检测试剂盒-荧光PCR法(江苏硕世生物科技股份有限公司)、VITEK2-Compact型全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃)、血琼脂平板(郑州安图)、B族链球菌检测试剂-胶体金免疫层析法(广州市微米生物科技有限公司)

1.3 方法

1.3.1标本采集 采用藻酸钙、普通棉拭子或涤纶拭子采集生殖道或直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本。(1)妊娠35-37周孕妇生殖道分泌物：先拭去阴道过多的分泌物，采用无菌拭子插入阴道至内1/3处，沿阴道壁轻轻旋转取得分泌物，将采集的拭子置于无菌管中，密闭送检，注明采集部位和采集时间。(2)妊娠35-37周孕妇直肠分泌物：将拭子插入肛门，在肛门括约肌以上约2.5 cm处，沿肠壁轻轻旋转取得标本，将采集的拭子置于无菌管中，密闭送检，注明采集部位和采集时间；(3)样本一经采集，则应尽快送至检测实验室。

1.3.2GBS检测 (1)细菌培养法：按照《全国临床检验操作规程(第4版)》规范操作。标本接种于血琼脂平板，在恒温培养箱35℃孵育18-24 h。挑取血平板上有β溶血的疑似GBS菌落分纯培养后，革兰染色阳性、触酶实验阴性，挑取典型菌落用Clin-TOF飞行时间质谱系统进一步鉴定，确认并记录结果。(2)实时荧光PCR检测GBS-DNA：对GBS的cfb基因编码区的保守区为靶区域，设计引物和探针。通过荧光标记的GBS特异性探针和内标对照探针检测GBS。核酸制备、扩增检测及阴阳性结果判断严格按照试剂盒说明书进行。(3)质谱快速鉴定法：将棉拭子标本置于专用增菌培养基，在恒温培养箱35℃孵育4 h。按照试剂盒说明书进行操作，使用飞行时间质谱系统微生物样本处理试剂处理后，用Clin-TOF飞行时间质谱系统进行检测。鉴定结果以置信度分数来判读，置信度≥25分，表示结果可信；置信度在<25分之间，该置信度下的鉴定结果不可靠，应重新处理菌株或重新采集样品点再测试。鉴定软件中每个数据均会产生10个鉴定结果，以置信度分数最高且排名第一的结果为准。(4)选择肉汤培养后涂平板培养法：标本接种于毅新博创B族链球菌增菌培养基中置35℃恒温培养箱中培养4 h后转种血平板，35℃孵育18-24 h，挑取血平板上有β溶血的疑似GBS菌落分纯培养后，革兰染色阳性、触酶实验阴性，挑取典型菌落用Clin-TOF飞行时间质谱系统进一步鉴定，确认并记录结果。(5)胶体金免疫层析法：严格按照试剂盒说明书进行操作和结果判读。

1.4 统计学处理

采用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理，采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。以细菌培养法作为金标准，计算其他检测方法的诊断性能评价指标。灵敏度=a/(a+c)×100%，特异度=d/(b+d)×100%，准确性=(a+d)/(a+b+c+d)×100%，阳性预测值=a/(a+b)×100%阴性预测值=d/(c+d)×100%，误诊率=b/(b+d)×100%，漏诊率=c/(a+c)×100%；a为真阳性标本例数，b为假阳性标本例数，c为假阴性标本例数，d为真阴性标本例数。

2 结果

2.1 检测结果比较278例标本中，细菌培养法检出阳性26例，阳性率9.4%；选择肉汤培养后涂平板培养法检出阳性29例，阳性率10.4%；实时荧光PCR法检出阳性51例，阳性率18.3%；质谱快速鉴定法检出阳性19例，阳性率为6.8%；胶体金免疫层析法检出阳性34例，阳性率为12.2%。细菌培养法、实时荧光PCR法、质谱快速鉴定法、选择肉汤培养后涂平板培养法、胶体金免疫层析法阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 诊断性实验性能评价以细菌培养法作为金标准，计算其他检测方法的诊断性能评价指标，结果见表2。选择肉汤培养后涂平板法准确度最高，为98.9%；灵敏度最高，为100.0%；漏诊率最低。质谱快速鉴定法特异度最高，为99.6%；阳性预测值最高，为94.7%；误诊率最低，为0.4%；但漏诊率最高，为30.8%。实时荧光PCR法特异度为88.0%；灵敏度为77.0%；误诊率最高，为12.0%。胶体金免疫层析法特异度为96.0%，灵敏度为92.3%，准确度为95.7%。4种诊断性实验阴性预测值均较高，达96.0%以上。4种诊断性实验灵敏度、特异度比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 诊断实验评价表(n)

表2 4种诊断性实验性能评价(%)

2.3 检测时长比较细菌培养法、选择肉汤培养后涂平板法、质谱快速鉴定法、实时荧光PCR法、胶体金免疫层析法检测GBS的时长分别为48-72 h、52-76 h、5-6 h、2-4 h、10 min，细菌培养法和选择肉汤培养后涂平板法耗时最长，胶体金免疫层析法耗时最短。

3 讨论

据美国CDC统计，产妇感染GBS的发病率为10%-30%，其中40%-70%的感染孕妇在分娩过程中将GBS传播至新生儿，1%-3%的带菌新生儿早期即可出现侵入性感染，感染患儿的病死率约为5%。孕妇经产道垂直传播GBS是导致新生儿感染的主要途径[12-14]。因此，产前进行GBS定植筛查有利于阻止和减少新生儿GBS感染[15]。有文献报道，孕妇GBS定植率为3.4%-15.8%，且定植率在不同国家、地区、人群种族间有一定差异，并受到人群年龄、教育程度、检测技术及检测频率的影响[16-17]。

产前生殖道分泌物普通细菌培养是目前是确诊GBS感染的金标准，普通细菌培养法检测GBS应用最广，鉴定的同时还可进行药敏试验。但缺点是检测时间长，而且GBS营养要求高，在血平板上生长易受阴道与直肠中其他细菌的干扰和抑制，从而导致漏检[18]。另外标本取材后若不及时进行处理，在环境、保存条件的影响下可诱导B族链球菌的凋零，从而导致无法培养检出，降低灵敏度低[16]。因此，寻找更为快捷、准确的GBS检测方法十分重要。

美国CDC自1996 年至今共发布了3版妊娠期GBS 筛查指南，我国在2010年开始公布妊娠期GBS 筛查指南。指南中直接接种细菌培养法被各大医院广泛应用，主要是细菌培养法对实验设备及场地要求不高，容易操作。但是研究表明，直接接种细菌培养法阳性检出率不高，临床容易出现漏诊[19]。相关文献报道，选择性肉汤增菌后转种细菌培养进行检测，能够获得更高的阳性检出率[20]。主要是因为直接培养法中菌种丰富，影响GBS的生长，加大了检测难度。而选择性肉汤培养基中包含有多粘菌素B、萘啶酮酸抗菌药，能够有效抑制受检者阴道样本中非目标菌种(多数为革兰阴性菌)的生长，虽然对GBS也会产生轻度抑制作用，但选择性肉汤培养基中的链球菌生长营养成分可同时有助GBS的生长，更利于检出。本文通过研究发现，选择肉汤培养后涂平板培养法阳性检出率为10.4%，准确度最高，为98.9%，特异度较高，为98.8%，漏诊率及误诊率均较低，但检测时间最长，成本最高，可作为普通细菌培养法的改良方法。因此，有条件的医院可将选择肉汤培养后涂平板培养法作为GBS检测的常规方法，其准确性及特异性均优于直接细菌培养法。

胶体金免疫层析法通过标记的单克隆抗体于GBS抗原特异性结合，抗原-抗体复合物被固相多克隆抗体捕捉后，出现红色带即为阳性。金标法具有以下特点：(1)操作简单：可直接检测标本，无需进行培养，不需要特殊的培养条件和设备，并可随时检测；(2)检测快速：仅需10 min即可完成检测，在几种常用方法中检测时长最短；(3)特异度较高：金标法检测GBS的特异度在几种常用方法中较高，达到96.0%。有研究称，孕妇阴道分泌物中分离的假豕链球菌会导致胶体金免疫层析法出现假阳性。因此，金标法适合作为门诊大规模常规初步筛查、基层医院常规筛查方法。

荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术作为一种重要的分子生物学方法，因其具有良好的特异性和敏感性而在临床广泛使用，近年来受到越来越多研究者的青睐。其具有实时、快速、准确等优点，适用于围产期筛查和紧急情况下的快速检测[21-22]。PCR 法是一种快速且高效的病原微生物检测的方法，可通过对不同种属特异性核算序列设计引物及不同荧光染料标记探针的应用，在高通量检测仪器的辅助下完成具有快速性、敏感性且高通量性的闭盖检测，具有检测结果准确可靠、敏感性高的优势[16]。其主要缺点是无法进行药敏试验，且检验结果容易受实验操作的影响，因此需要对实验人员进行完整是体系培训，对实验场地及实验人员均有较高的要求。应用PCR法进行GBS检测时，检出时间可控制在4小时内，耗时明显低于细菌培养法，因而具有很好的临床实践意义[23-24]。本文通过研究发现，PCR方法诊断GBS的特异度为88.0%，阴性预测值为97.4%，与国内研究一致[16,24]，提示实时荧光定量PCR对于GBS具有较好的诊断效能，可及时、准确的对GBS进行诊断。因此，PCR技术适用于孕妇GBS的快速筛查。理论上，PCR方法灵敏度和特异度均较好，但本实验中结果中灵敏度仅为77%，误诊率最高达12%；分析原因可能与阴道分泌物中可能存在干扰荧光成分有关、引物特异性有关，具体原因需要进一步研究证实。因此本研究认为，PCR法对于B族链球菌的临床实验诊断应用价值有待进一步研究。

MALDI-TOF-MS 是一种非常有前景的微生物鉴定方法，它具有很明显的准确性和高效性[25-26]。基于MALDI-TOF-MS在阳性血培养瓶、尿标本[11]微生物快速鉴定中的良好临床应用价值，其在液体标本中微生物快速鉴定的应用前景不容小觑。本文通过研究发现，质谱快速鉴定法在GBS筛查实验中特异度最高，为99.6%；阳性预测值最高，为94.7%；误诊率最低，为0.4%；但灵敏度最低，为69.2%。有相关文献报道，MALDI-TOF-MS在血培养微生物整体鉴定灵敏度为70.8%，其中阳性球菌鉴定灵敏度为52.9%；在尿液微生物整体鉴定灵敏度为78.6%，其中阳性球菌鉴定灵敏度为75.0%，与本文报道灵敏度较一致。MALDI-TOF-MS在阳性血培养微生物快速鉴定时，当血培养瓶中有两种及以上细菌时，常无法准确鉴定出细菌；在尿液微生物快速鉴定时[11]，当细菌含量低于104cfu/ml时，阳性球菌准确检出率低于17%。结合本研究分析其灵敏度较低的原因可能有，其一，液体培养基增菌后B族链球菌浓度仍较低，故可能导致无法检出；其二，液体培养基增菌后仍有较多其他细菌，干扰检测B族链球菌检测，导致无法检出。将增菌后的液体培养基涂布平板后发现部分阳性标本中仅有少量B族链球菌，其菌量占比低于10%；此外涂布平板后发现仍有较多肠杆菌科细菌(如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等)、肠球菌(屎肠球菌、粪肠球菌等)、葡萄球菌属等细菌。本实验采用的增菌培养基配方主要成分为BHI肉汤、多粘菌素B、萘啶酮酸、纯水，其中多粘菌素B、萘啶酮酸对多种阴性菌有抑制作用。快速质谱法在4种GBS筛查方法中特异度最高，达到99.6%；阳性预测值最高，为94.7%，在临床应用中，其快速诊断有不容小觑的应用前景。

综上所述，与细菌培养法相比，选择肉汤培养后涂平板法、实时荧光PCR法和胶体金免疫层析法方法筛查GBS的检出率均较高。胶体金免疫层析法操作简单、检测快速、特异度较高，金标法适合作为门诊大规模常规初步筛查、基层医院常规筛查方法。实时荧光定量PCR对于GBS具有较好的诊断效能，可及时、准确的对GBS进行诊断，PCR技术适用于孕妇GBS的快速筛查。基于选择肉汤培养后涂平板法准确度高、灵敏度高，但检测时间最长，成本最高，可作为普通细菌培养法的改良方法，有条件的医院可作为常规筛查方法。快速质谱法在GBS筛查实验中特异度最高，阳性预测值最高，在临床应用中，快速诊断有不容小觑的应用前景。