IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A与再生障碍性贫血的相关性分析

孔令环,王雪野,邢明雨,吕作福,艾英莉,邵万艳,魏灼如

(吉林省人民医院，吉林 长春130021)

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是由于原因不明因素引起骨髓造血干细胞和(或)微环境损害，骨髓增生低下，外周血全血细胞减少的一组临床综合征，本质上是由免疫异常介导的造血功能障碍疾病。以往认为Th1细胞、Th2细胞介导的异常免疫应答是AA发病机制中的主要环节，另有研究[1]表明Th17分泌的IL-17A在AA的免疫发病机制中占有重要地位。本研究通过IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A等细胞因子水平变化，判断Th1、Th2、Th17平衡状态，了解机体免疫功能，进一步探讨AA的发病机制，有助于临床探索新的AA治疗方案。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2020年1月至2022年9月吉林省人民医院血液科收治再生障碍性贫血初治病人54例，其中重型(SAA)25例，非重型(NSAA)29例。SAA组，男11例，女14例，年龄27-87岁，中位年龄58岁；NSAA组，男9例，女20例，年龄18-84岁，中位年龄58岁。免疫抑制剂治疗有效组(贫血出血症状明显好转，不输血，1个月内血红蛋白增长30 g/L以上)16例，其中男6例，女10例，年龄21-64岁，中位年龄50岁。按照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[2]，符合再生障碍性贫血的诊断标准。同时，选择本院健康志愿者30例为对照组，男7例，女23例，年龄29-54岁，中位年龄44岁，均知情同意。

1.2 检测方法

采用流式细胞术检测细胞因子。受试者清晨空腹静脉采血2 ml，EDTA抗凝，离心，血浆冻存在-80℃冰箱。试剂选购BDTMCytometric Bead Array(CBA) Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit;仪器为BD FACSCanto II流式细胞仪。同时常规进行血常规及T淋巴细胞亚群检测并记录结果。

1.3 操作步骤

1.3.1制备人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品是冻干粉，因此实验前需要重悬并进行梯度稀释。

1.3.2混合人Th1/Th2/Th17细胞因子捕获微球 7种捕获微球分别装在7个小瓶中(A1-A7)，使用前应将7种微球立即混在一起，混合的捕获微球按需求移到实验管中。

1.3.3对荧光试剂处理好的人的Th1/Th2/Th17流式样本进行检测 50 μl血浆+50 μl混合微球+50 μl PE抗体，避光3 h,加入Wash Buffer 1 ml,混合离心5 min,弃上清,加300 μl Wash buffer.混匀，上机。用仪器调整微球做仪器条件设置。检测指标有7个：IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IL-4。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 AA病人外周血中细胞因子水平

NSAA组病人IL-2，TNF-α水平低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);NSAA组病人IL-6，IFN-γ/IL-4水平高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；NSAA组病人IL-10,IL-17A,IFN-γ水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1、2。

SAA组病人外周血中IL-2，IL-10水平低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);SAA组病人IL-17A，IFN-γ，IL-6，IFN/IL-4水平高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、2。

表1 AA病人IL-2、IL-10、IL-17A、IFN/TI-4水平

表2 AA病人IL-4、IL-6、TNF、IFN、水平

2.2 AA病人免疫抑制剂治疗后,有效组IL-2、IL-10、IL-17A、IFN-γ/IL-4水平

AA病人免疫抑制剂治疗后IL-2、IL-17A水平减低，与AA组比较差异有统计学意义(P<0.05);IL-10、IFN-γ/IL-4水平与AA组比较差异没有统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 AA病人免疫抑制治疗前后IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN/IL-4水平

2.3 AA病人细胞因子与血细胞(WBC,HB,PLT,ANC中性粒细胞比例,淋巴细胞比例)相关性

SAA组:IFN-γ与ANC有相关性,r=-0.563,P=0.003;IL-6与ANC有相关性,r=-0.477,P=0.016;Th1/Th2与ANC有相关性，r=-0.444，P=0.026。NSAA组：IL-6与WBC有相关性,r=-0.464,P=0.011;IL-6与淋巴细胞有相关性，r=-0.467,P=0.011。

2.4 AA病人外周血细胞因子之间以及与T淋巴细胞亚群的相关性

NSAA组：IL-10与CD8+T细胞有相关性,r=0.369,P=0.049;IL-10与B淋巴细胞有相关性,r=-0.532,P=0.003;IL-17A与IFN-γ有相关性,r=0.544,P=0.002;IL-2与IL-17A有相关性,r=0.443,P=0.016;IL-2与IFN-γ有相关性,r=0.545,P=0.002;IL-2与IL-4有相关性,r=0.531,P=0.003。

SAA组：IFN-γ与IL-6有相关性,r=0.487,P=0.014;IL-10与IL-6有相关性，r=0.662,P=0.001；IL-2与IL-4有相关性,r=0.463,P=0.02;IL-4与B淋巴细胞有相关性，r=-0.409,P=0.042；IL-4与CD8+T细胞有相关性，r=0.422,P=0.035。

3 讨论

AA 的发病与免疫异常密切相关[3-4]。尤其是CD4+T细胞功能紊乱，CD4+T细胞主要分为Th1和Th2。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，主要参加细胞免疫应答。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、和IL-10等，刺激B淋巴细胞增殖并产生抗体，主要介导体液免疫应答过程。IFN-γ和IL-4分别是Th1细胞和Th2细胞发挥功能的关键的细胞因子，常用IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2平衡。Th1/Th2平衡是免疫应答的关键环节，病理条件下Th1/Th2极化异常或缺陷参与自身免疫性疾病的发生发展。现有研究发现[5-6]，再障患者呈现Th1细胞极化现象，造血负调控因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平增高，Th1/Th2细胞比例明显失衡。Kaito[7]等通过检测再障患者IST治疗后外周血Th1/Th2细胞比例发现，治疗有效者Th1细胞数量、Th1/Th2比例均低于治疗无效者，进一步说明Th1淋巴细胞在再障发病中占优势。结论与本研究一致，AA病人(包括SAA和NSAA病人)Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)均高于对照组，差异有统计学意义。还发现SAA病人Th1/Th2与ANC呈负相关，证明Th1淋巴细胞在再障发病中占优势；SAA组与NSAA组之间TH1/TH2无显著性差异，提示Thl细胞的增多与疾病的严重性无关。

Th17细胞是一种新的CD4+T细胞亚群，参与炎症、感染、自身免疫性疾病等多种病理过程[8]。IL-17A是Th17细胞分泌的最具特征性的细胞因子，属于IL-17细胞因子家族中的一员。IL-17A是一种致炎因子，具有独立的分化发育调节机制,能诱导巨噬细胞分泌高水平的IL-6,TNF-α等造血负调控因子[9]。本研究中，SAA组的IL-17A水平高于对照组，IST治疗后明显降低，与陆翔等[10]报道一致,IL-17A能诱导巨噬细胞分泌高水平的IL-6,TNF-α等造血负调控因子,抑制骨髓造血，参与AA病理过程。免疫抑制剂治疗后IL-17A水平明显降低，对骨髓抑制作用减低，造血恢复，所以血红蛋白浓度升高。IL-17A在SAA与NSAA中表达水平有显著性差异，所以分泌IL-l7A的Th17细胞与疾病的严重性相关。随着IST治疗，IL-l7A水平降低,IL-17在疾病严重程度及治疗疗效中表达不同，提示其可以作为AA诊断及预后的重要指标。

IL-10具有免疫抑制和抗炎作用，通过下调巨噬细胞的抗原呈递功能，从而抑制Th1细胞产生造血负调控因子如IFN-γ,TNF等，抑制NK细胞活化，下调免疫应答。同李文静等[11-12]研究一致,本研究中发现AA组病人IL-10水平减低，免疫抑制作用降低，对Th1抑制减低，分泌更多造血负调控因子，抑制骨髓造血功能，促进AA的发生。Asano等[13]观察IL-10对造血祖细胞生长的影响，发现IL-10能显著增强CFU-E的形成，或许可以利用IL-10作为AA的支持性治疗工具，通过抑制IFN-γ而促进红系造血岛的形成，对AA具有治疗作用。

Chen等报道[14],IFN-γ等抑制性因子通过Fas通路、半胱天冬酶和相关促凋亡基因的上调降低造血基因的表达，上调IFN-γ基因增强小鼠凋亡基因表达及活化细胞毒性T细胞，增加造血干细胞和祖细胞破坏。Capone等[15]证明微量内源性IFN-γ即产生强大抑制效应，所以低浓度IFN-γ足以产生骨髓抑制。与本研究相符，通过相关性分析发现SAA病人IFN-γ、IL-6与ANC呈负相关，NSAA病人的IL-6与WBC、淋巴细胞呈负相关；SAA组病人IFN-γ和IL-6水平高于对照组，NSAA组IL-6水平高于对照组；可以认为造血负调控因子IFN-γ和IL-6直接参与了AA疾病的发生过程。本研究中AA病人IFN-γ比例增加，IST治疗后比例降低，同报道一致[12]，说明IFN-γ也是AA区别其他血液病所导致的血细胞减少的标志之一。

另外，Dutta等[16]研究证实，骨髓和外周血中，IL-2,TNF-α,andIFN-γ水平均升高，而且PBP和BMP中的3种细胞因子水平均呈正相关。所以检测外周血中IL-2,TNF-α,and IFN-γ因子水平可以代替骨髓，判断骨髓造血的抑制程度，更方便临床观察和治疗。

有研究报道[17]，体外高浓度的IL-2可以提高Treg的数量，提出临床AA治疗除了标准IST外，低剂量和/或低亲和力IL-2治疗AA的潜在作用，以扩大自体Treg细胞的数量，改善患者的临床预后。本研究中SAA和NSAA病人IL-2水平均低，免疫抑制剂治疗有效组IL-2水平继续减低。如果能提高AA病人体内IL-2水平或许可以改善体内Treg细胞数量和功能，给AA治疗找出一条新思路。

造血的免疫调节因素包括各种细胞及其分泌的细胞因子之间互相调节[18-19]。例如，本研究中NSAA组病人IL-2与IL-17A,IFN-γ，IL-4均呈正相关;IFN-γ与IL-17A、IL-2有相关性；SAA组：IL-6与IFN-γ、IL-10有相关性；IL-4与IL-2有相关性。当造血负调控因子占主导时，骨髓造血功能受抑制，则导致AA的发生；免疫抑制治疗后，造血负调控因子减少，则造血恢复。本研究发现，AA病人主要是IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-10、IL-2水平异常，直接或间接参与了造血调控，与骨髓造血衰竭相关，是AA发病机制中的主要环节。调控机体内的白介素水平，或许能成为疾病治疗和预防的新途径。