郑州市134例结核病患者结核分枝杆菌分离株的耐药特点分析

曹小九，李洪智，张晓琦

结核病是因机体感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)所致，传染性强，潜伏期4～8周，可导致人体多个脏器受累，如肾脏、肺部、脑部等，以肺结核最为常见，传播途径包括母婴传播、饮食传播、空气传播等[1]。目前，临床上结核疾病以药物治疗为主，常用抗结核药物有乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、利福平等，但患者多存在耐药，耐多药菌已成为抗结核效果欠佳的重要原因[2]。据报道[3]，某城市新发结核病患者耐多药率为4.8%～8.7%，复发结核病患者耐多药率达25.6%～26.3%，治疗较困难。耐药菌播散会造成患者个人及其家庭、社会成员感染，若未能及时遏制，则会导致更多人遭受耐药MTB侵袭，引起新传染源，增加治疗难度[4]。为了解本市结核病患者MTB分离株对抗结核药的耐药特点，本研究分析了134例结核病患者的耐药特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2020年3月—2022年3月收治的郑州市结核病患者134例进行回顾性分析，其中初治患者75例，复治患者59例。纳入标准：符合结核病相关诊断标准[5]；经痰液MTB培养提示存在致病菌生长；年龄≥15岁；资料齐全。排除标准：重要脏器出现器质性病变；凝血功能异常；患免疫性疾病、肿瘤疾病、神经系统疾病、癫痫等；患其他类型的感染性疾病。

1.2 主要设备和试剂 主要仪器为L535R型高速离心机(湖南湘仪集团)、DW-86L34B型低温保存箱(澳柯玛股份有限公司)、XK96-A振荡器(姜堰市新康医疗器械有限公司)。主要试剂为硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic acid,PNB)、分枝杆菌药敏罗氏培养基，均购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 采集所有受试者晨痰4 mL，置于无菌培养盒中，制备3张痰涂片，行瑞氏-姬姆萨染色，观察细胞计数及分类情况。经低倍镜观察，若鳞状上皮细胞数目<10个，且白细胞数目>25个，则提示样本满足检测要求。

1.3.2 MTB培养 将4 mL痰液标本置于离心管内，加入4倍量2%氢氧化钠溶液，经振荡器振荡10～20 s，使样本液化。室温下静置15 min，加入45 mL磷酸盐缓冲液，拧紧螺旋盖。在8 ℃下行离心处理，时间20 min(3 000×g)，弃上清液。加入磷酸盐缓冲液1 mL，充分混合。将处理后的样本接种于培养基，每支0.4 mL，标记接种日期及编号，37 ℃水平孵育48 h，然后调整为直立培养，拧紧盖子。接种3～7 d后，观察有无菌落生长，之后每间隔1周观察1次，了解有无菌落生长。若存在菌落生长，且行抗酸染色证实为分枝杆菌，则提示分枝杆菌阳性，若观察8周后，仍无分枝杆菌生长，则提示阴性。

1.3.3 MTB鉴定 分别制备PNB与TCH培养基。PNB培养基：取PNB溶液加至罗氏培养基，使最终浓度为0.5 mg/mL，平分装于培养管，经凝固器凝固(85 ℃)，灭菌处理50 min，存至4 ℃环境备用。TCH培养基：经10 mL灭菌水稀释TCH溶液(5 mg)，取稀释后溶液1 mL加入罗氏培养基，使最终浓度为5 μg/mL，平分装于培养管，灭菌处理50 min，存至4 ℃环境备用。若TCH、PNB均不生长，则提示为牛分枝杆菌，若TCH生长，PNB不生长，则提示MTB，若两者均生长，则提示非MTB。

1.3.4 药敏试验 利用比例法进行药敏试验。首先准备含药培养基，本次分析的抗结核药物包括一线药物如异烟肼、乙胺丁醇、链霉素及利福平，二线药物如左氧氟沙星、卡那霉素、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺、阿米卡星及卷曲霉素，药物最终浓度依次如下：0.2、2.0、4.0、40.0、2.0、30.0、1.0、40.0、1.0、40.0 μg/mL。无菌分装于试管，5毫升/管，在85 ℃下凝固50 min，于4 ℃下存储备用。选取4周左右菌龄的菌株行药敏试验，低温环境取出培养基，平衡至室温，标记受试者的姓名、编号、日期等信息。取2滴10% Tween80加入磨菌瓶，并加入细菌，对接种环行加热灭菌处理。将磨菌瓶封盖，振荡30 s，加生理盐水混匀。将菌液吸入无菌试管，加生理盐水，使菌液浓度为1 mg/mL。用接种环取2环菌液，加入灭菌生理盐水(2 mL)中，予以100倍稀释，取稀释后菌液2环，加入灭菌生理盐水(2 mL)内，予以10 000稀释。分别取1环10-4菌液，接种于含药培养基、对照培养基，分别取1环10-2菌液，接种于含药培养基、对照培养基。封盖，竖直在37 ℃下培养，待4周可出报告结果。报告标准[6]如下：(1)阴性：无菌落生长；(2)实际菌落数：菌落<50个；(3)1+：菌落为50～100个；(4)2+：菌落为101～200个；(5)3+：菌落为201～500个；(6)4+：菌落>500个。耐药百分比=(含药培养基菌落数/对照培养基菌落数)×100%，若该百分比≥1%，则提示耐药，否则提示敏感。

1.4 耐药定义分析 方法如下[7]：(1)单耐药：仅对一种一线药物耐药；(2)多耐药：对≥2种(及以上一线)药物耐药(不含对异烟肼、利福平同时耐药)；(3)耐多药：至少对利福平、异烟肼同时耐药；(4)广泛耐药：在耐多药基础上，至少对一种二线药物或氟喹诺酮类药物耐药。

1.5 质量控制 药敏试验和痰培养方法均符合相关实验室操作规程，操作时严格根据说明书进行，遵循无菌原则。药敏试验质控以H37RV为标准对照，确保质量。同组检测人员对菌株及耐药情况检测。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计数资料用n，%表示，率的比较行χ2检验或校正χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核病患者MTB耐药情况分析 134例患者共分离出MTB 134株，54(40.30%)株为耐药菌，其中单耐药11(20.37%)株，多耐药15(27.78%)株，耐多药14(25.93%)株，广泛耐药14(25.93%)株。不同性别、年龄的患者间耐药情况比较差异无统计学意义(P>0.05)；复治者耐药率高于初治者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 不同类型结核病患者MTB分离株耐药类型比较 2种类型患者MTB单耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05)。复治患者多耐药率、耐多药率及广泛耐药率均高于初治患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 结核病患者MTB耐药情况分析

表2 不同类型结核病患者MTB分离株耐药类型比较

2.3 不同类型结核病患者MTB分离株耐药组合特点比较 初治患者和复治患者的药物组合耐药情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同类型结核病患者MTB分离株耐药组合特点比较

2.4 不同类型结核病患者MTB分离株任意耐药分布特点比较 复治患者异烟肼、乙胺丁醇、链霉素及利福平耐药率均明显高于初治患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同类型结核病患者MTB分离株任意耐药分布特点比较

3 讨论

我国结核病新发病例占全球的15%，患者带菌时间长，主要通过呼吸道传播，治疗周期长[8]。现阶段以抗结核药物治疗为主，虽取得一定效果，但随着用药时间延长，容易产生耐药性，若早期耐药未能获得有效、及时的控制，可进展为广泛性耐药，进一步加大治疗难度[9]。合理控制耐药率，寻找新的治疗方案，仍是临床关注的重点。我国结核病完全治愈率并不理想，做好结核病防控和耐药预防显得格外重要[10]。目前，本市结核病耐药情况尚未完全明确，分析本市结核病耐药特征可为该病干预提供依据。

本研究结果显示，134例结核病患者共检出134株MTB，其中对抗结核药耐药的比例高达40.30%。李晓晓等[11]分析422例结核病患者耐药特点，发现耐药率为38.6%，与本次结果接近。国外有研究[12]发现，结核病患者的耐多药和广泛耐药率较高，认为主要与MTB生长缓慢和治疗周期长有关。本研究复治患者的耐药率高于初治患者，尤其多耐药率、耐多药率、广泛耐药率明显。分析原因可能与复治患者接受治疗次数更多，治疗周期更长有关，导致耐药的风险增加。部分初治患者经过短期治疗后病情好转，自行停药不久后复发，这类患者往往依从性欠佳[13]。部分患者因不能耐受抗结核药物引起不良反应，导致中途停药，出现用药不规律或不规范现象[14]。左延才等[15]分析了888例结核病患者，发现复治患者的耐药率高达38.60%，明显高于初治患者的15.65%，同样显示复治患者耐药率高。本研究复治患者耐药率达66.10%，高于继往研究结果，可能与样本量、治疗周期不同有关。

抗结核药物治疗既有单一用药，也有采用联合用药方案。本研究结果显示，初治、复治患者不同药物组合方案耐药率未见差异。初治患者一线抗结核药物(包括异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、利福平)的任意耐药率低于复治患者。一线药物为治疗结核病的首选药物，疗效多可靠，但随着病程和用药周期的延长，易产生耐药性，尤其是复治病例。解冰洁等[16]发现，结核病患者不仅对一线药物耐药率高，而且对二线药物卡那霉素、氧氟沙星的耐药率也较高。而本研究中初治、复治患者对二线药物的任意耐药率均较低，与上述研究结论不同。这可能与用药特点不同有关，本市一线药物使用频率高，二线药物频率相对较低，故二线药物耐药风险更低。

综上所述，本市结核病患者对一线抗结核药物总体耐药率高，特别是复治患者的多耐药率、耐多药率、广泛耐药率，任意药物耐药中主要对一线药物耐药。因此，本市需加强抗结核药物的用药管理，采取耐药率控制措施，以降低结核杆菌耐药风险。