LC-MS/MS法测定人血浆伊曲康唑和羟基伊曲康唑浓度

韦佳佳，傅雷宇，董露露，凌静，胡楠，蒋艳，杨旭萍

伊曲康唑(itraconazole，ITZ)是第一代三唑类高效广谱抗真菌药，通过抑制麦角固醇合成通路上的细胞色素P450羊毛固醇14α-去甲基化酶发挥抗真菌作用[1]。对皮肤癣菌、孢子丝菌属、念珠菌属、暗色及双相真菌等均具有较高的抗菌活性，在临床治疗真菌感染方面应用广泛[2]。伊曲康唑具有非线性药代动力学特征，长期或大剂量使用可能引起药物蓄积，从而产生毒副作用，对肝药酶及肠P-糖蛋白(P-gP)的抑制作用可增加药物相互作用不良反应(adverse reactions，ADR)发生风险。因此，临床应注重治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)，调整给药剂量，从而保障患者的用药安全[3-4]。伊曲康唑主要通过细胞色素P450酶CYP3A4代谢，羟基伊曲康唑(hydroxyitraconazole，HITZ)为主要代谢产物，具有与原形药物等效的抗菌活性[5]。本研究拟建立简便、快速、准确的人血浆伊曲康唑和羟基伊曲康唑的液相色谱-串联质谱法( LC-MS/MS)测定方法，为临床TDM提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 Jasper HPLC液相色谱仪(岛津,日本)、AB Sciex Triple Quad 4500MD型液相色谱串联质谱检测系统(AB SCIEX公司，美国)、 Vortex-Genie 2涡旋混合器(scientific industries，美国)、5417R低温高速离心机(eppendorf，德国)、Direct-Q纯水仪(millipore，美国)、BT25S电子分析天平(sartorius，德国)。

1.2 药品与试剂 伊曲康唑(加拿大TRC公司；纯度：98%；批号：13-GHZ-186-1)、羟基伊曲康唑(加拿大TRC公司；纯度：97%；批号：11-KSS-103-4)、伊曲康唑-d9(中国Cmass公司；纯度：97%；批号：2-OMK-97-1)。伊曲康唑、羟基伊曲康唑的内标为伊曲康唑-d9。甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)均购自美国Merck公司；甲酸(分析纯度)、乙酸铵(分析纯度)均购自美国Sigma-Aldrich公司；实验用水由实验室Milli-Q超纯水系统自制。

1.3 方法

1.3.1 液相色谱及质谱条件 (1)色谱条件。色谱柱为Kinetex C18(3 mm×100 mm，2.6 μm)，柱温：40 ℃，进样量：5 μL，流动相A：5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸的水溶液，流动相B：0.1%甲酸的甲醇溶液，流速：0.6 mL/min，洗脱方式：梯度洗脱，其中0.01～0.80 min，B相浓度40%，0.80～1.00 min，B相浓度40%→90%，1.00～3.50 min，B相浓度90%，3.50～4.00 min，B相浓度90%→40%，4.00～5.00min，B相浓度40%。(2)质谱条件。离子源：电喷雾电离源(ESI)，离子极性：正离子模式，扫描方式：多重反应监测(MRM)，喷射电压：5 500 V，源温度：550 ℃，雾化气：50 psi，辅助气：50 psi，气帘气：35 psi，碰撞气：8 psi。各成分选用的离子对和DP、CE电压如下：ITZ：m/z705.2 → 392.2，170V和50V；HITZ：m/z721.5 → 408.3，170V和50V；内标ITZ-d9：m/z714.3 → 401.4，160V和50V。

1.3.2 对照品贮备液的配制 精密称取伊曲康唑和羟基伊曲康唑标准品适量，分别用甲醇定量配制成0.5和1 mg/mL的标准储备液，用甲醇依次稀释成浓度为1、2、5、10、20、50、100、200 μg/mL的标准工作液和3、30、150 μg/mL的质控工作液。精密称取伊曲康唑-d9标准品适量，200 μg/mL的内标储备液由乙腈定量配制，临用前用甲醇稀释为500 ng/mL的内标工作液。

1.3.3 样品处理方法 精密吸取样本血浆50 μL置于1.5 mL EP管中，加入500 ng/mL的内标工作液150 μL，涡旋振荡3 min，16 400 r/min，离心10 min，取上清液20 μL置于1.5 mL EP管中，用50%甲醇水溶液稀释至200 μL，置于自动进样器。

2 结果

2.1 ITZ、HITZ及内标专属性分析 取6份不同个体的人空白血浆，加入工作液制成定量下限样本(0.1 μg/mL)和中浓度质控样本(3 μg/mL)，按“1.3.3”项方法处理并按“1.3.1”项条件进行LC-MS/MS分析。结果如图1所示，ITZ、HITZ及内标(ITZ-d9)保留时间分别为 2.43、2.27及2.42 min，血浆中相应色谱峰保留时间内均无内源性组分干扰，方法特异性良好。

2.2 ITZ和HITZ标准曲线 在人空白血浆中加入“1.3.2”项系列标准工作液，分别配制成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的标准血浆样本，按“1.3.3”项样品处理方法处理后行LC-MS/MS分析，以待测物与相应内标峰面积的比值为因变量(Y)，待测物浓度为自变量(X)，构建线性回归模型，得出相应标准曲线，以加权(W=1/χ2)最小二乘法进行线性回归运算。 ITZ标准曲线为Y=0.9819X+0.0189(r=0.9959)，HITZ标准曲线为Y=0.5474X+0.0131(r=0.9977)。ITZ和HITZ的检出限均为0.002 μg/mL，定量限均为0.005 μg/mL。

2.3 不同浓度 ITZ和HITZ准确度和精密度分析在人空白血浆中分别加入“1.3.2”项质控工作液，配制成0.1、0.3、3、15 μg/mL质控样本，按“1.3.3”项方法处理样品后行LC-MS/MS分析，每个浓度6份，在2周内测定3次。根据当日的标准曲线计算批内和批间准确度和精密度。结果显示，不同浓度羟基伊曲康唑和伊曲康唑准确度范围为90.69%～114.20%，精密度RSD为1.19%～8.70%，满足生物样本的检测需求。见表1。

表1 人血浆样本中ITZ和HITZ准确度和精密度

1A 空白血浆色谱图 1B 空白血浆添加定量下限对照品色谱图(0.1 μg/mL) 1C 空白血浆添加中浓度对照品色谱图(3 μg/mL) 1D 临床样品色谱图图1 ITZ和HITZ及内标ITZ-d9提取离子色谱图

2.4 不同浓度ITZ和HITZ提取回收率和基质效应分析 在人空白血浆中分别加入“1.3.2”项的质控工作液，配制成0.3、3、15 μg/mL的质控样本，每个浓度6份，按“1.3.3”项方法处理后，按“1.3.1”项条件行LC-MS/MS分析，得到待测物峰面积A1。人空白血浆经蛋白沉淀处理后，取上清液并加入质控工作液，配制成0.3、3、15 μg/mL质控样本，每个浓度6份，同“1.3.3”项方法处理后进样行LC-MS/MS分析，得到待测物峰面积A2，峰面积比A1/A2求得3种浓度待测物的提取回收率。结果显示，3种浓度提取回收率范围为80.49%～93.70%，RSD均<15%。另以纯水配制0.3、3、15 μg/mL 3个浓度的样本，每个浓度6份，同“1.3.3”项方法处理后得到待测物的峰面积A3，峰面积比A2/A3可求得3种浓度的基质效应。结果显示，3种浓度基质效应范围为123.75%～136.63%，RSD均<15%。见表2。提取回收率及基质效应均符合方法学要求。

2.5 不同浓度ITZ和HITZ稳定性分析 在人空白血浆中分别加入“1.3.2”项3个浓度的质控工作液各5 μL，每个浓度6份，分别在室温下放置24 h；在4 ℃下放置72 h，56 ℃水浴30 min，在-80 ℃下，反复冻融3次，按“1.3.3”项方法处理后进样行LC-MS/MS分析，分析处理后样本在自动进样器(15 ℃)中放置6 h的稳定性。结果显示，不同浓度ITZ和HITZ测定值与理论值的平均偏差均在±15%范围内， ITZ及其代谢物在本实验涉及条件下稳定。见表3。

表2 人血浆样本中ITZ和HITZ提取回收率和基质效应分析

2.6 临床应用结果 经医院伦理委员会批准同意,应用本研究所建立的方法测定了2020年3月—2021年3月 常州市第一人民医院收治的8例侵袭性真菌感染患者口服伊曲康唑3天后达稳态的血浆ITZ和HITZ浓度，其中男性3例，女性 5例，感染灶均位于肺部，真菌培养结果均显示曲霉菌感染，均采用伊曲康唑口服液(150 mL∶1.5 g)20 mL bid的用药方案。见表4。

表3 人血浆样本中ITZ和HITZ稳定性分析 (n=6)

表4 服药患者血浆中ITZ和HITZ的血药浓度

3 讨论

伊曲康唑因口服吸收快、半衰期长、生物利用度高等优点被广泛应用于临床抗真菌治疗。但随之出现的不良反应也在增多，使药物使用受到限制，血药浓度监测对调整给药剂量，减少药物不良反应具有重要意义[6-7]。目前，同时测定人血浆中伊曲康唑及其代谢物的方法主要有微生物法、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography ，HPLC)法及LC-MS/MS法[8-9]，由于羟基伊曲康唑会明显增强微生物活性，微生物检测结果可比HPLC法高出2～3倍，最终导致检测准确度降低，而HPLC法分析时间较长，不适用于治疗药物监测[10]。本研究通过Jasper HPLC液相色谱仪进行分离、富集ITZ和HITZ，用AB Sciex Triple Quad 4500MD型质谱仪进行监测，处理方法简单、易于操作，准确度高，特异性强，适于临床血药浓度监测。伊曲康唑在体内的主要代谢产物为羟基伊曲康唑，其活性与伊曲康唑基本一致。由于伊曲康唑的临床疗效与血浆药物的浓度和相互作用的药物相关，临床使用过程中通过治疗药物检测及时调整剂量，优化治疗效果，从而避免药物毒性。相关文献[11]指出，当伊曲康唑有效浓度>0.5 μg/mL，不建议谷浓度高于5 μg/mL 。

伊曲康唑不仅广泛应用于各种抗真菌感染治疗，对多种肿瘤的抗癌作用亦显著[12]。李慧霞等[13]研究发现，伊曲康唑可促进腺苷酸蛋白激酶磷酸化诱发结直肠癌细胞铁死亡，抑制结直肠癌细胞的增殖。毕菡等[14]认为伊曲康唑可能通过调节Ca2+信号通路和癌症转移途径有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。江帆等[15]研究表明，伊曲康唑能够通过调节B细胞淋巴瘤/白血病-2同源拮抗剂1信号通路的活化从而发挥抗胰腺癌作用。此外伊曲康唑在预防治疗上也有应用，李慧等[16]分析发现，伊曲康唑可预防淋巴瘤患儿应用利妥昔单抗治疗期间的继发感染，通过伊曲康唑血药浓度调整给药剂量，降低感染率，具有较高的安全性。

本研究建立的LC-MS/MS法，特异性强，灵敏度高，操作简单，血浆样品用量少，分析时间较短，适用于临床治疗药物监测。