儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 及H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒作用研究

胡月

流感病毒属于正黏病毒科,依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同,目前可分为若干个亚型(H1～H16,N1～N9)［1］,H1N1 是感染人的最主要甲型流感病毒,是临床上最常见的引起上呼吸道感染的流感病毒株,临床上表现为突发高热、咳嗽、咽痛、流涕或鼻塞、头痛、肌肉和关节痛、全身不适等多种流感样症状,影响患者的工作和生活［2］。目前,流感疫苗仍是最主要的流感预防措施,但因为流感病毒在不断变异,存在疫苗的研究和生产跟不上病毒变异速度的问题［3］。西药抗病毒毒副作用大,特异性低,易于产生耐药。中医药防治流感病毒临床诊治经验丰富,疗效确切,毒副作用低,患者接受度高。本研究委托中国科学院武汉病毒研究所,以利巴韦林为阳性对照,在MDCK 细胞水平上,评价儿童清咽解热口服液对H1N1及H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒的抗病毒作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂

1.1.1.1 受试药物 儿童清咽解热口服液,由亚宝药业四川制药有限公司生产,批号171041。

1.1.1.2 对照药物 利巴韦林标准品,购置于大连美仑生物科技有限公司,批号20160518。

1.1.1.3 试剂和仪器 ①试剂：DMEM 培养基(Life Science: Cat.No.12800-17,Lot No.1837973)、FBS(Biological Industry: Cat.No.04-001-1ACS-500 ml,Lot No.1837973)、青-链霉素(碧云天：Cat.No.ST488,配置成200000 U/ml)、DMEM 完全培养基(DMEM+10%FBS+100 U/ml PS)、RPMI1640 完全培养基(RPMI1640+10%FBS+100 U/ml PS)、磷酸盐缓冲液(1000 ml ddH2O中加入NaCl 8.1816 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 3.58 g,KH2PO40.24 g,搅拌溶解,调pH 至7.3)、胰酶(Trypsin)、CellTiter GloTM(Promega,货号：G7572,Lot No.0000158064)。②仪器及实验环境：二氧化碳(CO2)培养箱(Thermo)、生物安全柜(哈东联)、酶标仪(PerkinElmer,型号Envision)、细胞计数仪(Bio-Rad,型号TC10TM)、倒置显微镜(Zeiss Observer,型号A1)、高内涵细胞分析仪(PerkinElmer HCS)。

1.1.2 细胞与病毒 细胞：MDCK 来源于中国病毒保藏中心,从美国模式培养物集存库(ATCC)购置,本实验室传代保存为P8～P11 代。培养条件：DMEM+10%FBS、37℃、5% CO2。H1N1 病毒：A 型流感病毒(H1N1,A/PuertoRico/8/1934),该批次病毒编号为20161102NS。H1N1 奥司他韦耐药病毒株：来源于中国病毒保藏中心,由本实验室扩增保存。

1.2 方法

1.2.1 药物对细胞的毒性测定 实验采用CellTiter-GloTM荧光法检测受试药物对细胞的毒性作用。将MDCK 细胞接种于96 孔细胞培养板中,细胞贴壁后备用。儿童清咽解热口服液和利巴韦林用DMEM 培养基从2 倍最高测试浓度起连续3 倍梯度稀释8 个梯度,再将不同浓度的药物及适量培养基加入到细胞中,于37℃的CO2培养箱中培养。加入不同浓度儿童清咽解热口服液或利巴韦林培养22 h 后,显微镜下观察药物引起的细胞病变效应(CPE),并加入CellTiter-Glo 检测细胞存活率。药物对细胞的毒性以细胞的活性表示。计算公式：细胞活性(%)=(荧光值药物组-荧光值空白对照)/(荧光值细胞对照-荧光值空白对照)×100。

利用Graphpad Prism 作图并计算CC50和CC0.1。其中CC50通过软件中的计算公式log(inhibitor) vs.normalized response-Variable slope 计算得出,而CC0.1通过软件中的计算公式log(agonist) vs.response -Find ECanything 计算得出。

1.2.2 病毒毒力的测定(TCID50) 将H1N1 和H1N1奥司他韦耐药病毒株连续10 倍递次稀释为l0-1～10-8后,将各稀释度的病毒接种于MDCK 细胞中,每个稀释度4 孔,于37℃吸附1 h 后换用维持液继续培养,设正常细胞对照孔和病毒对照孔。72 h 后,取细胞培养液上清测定血凝素(HA),并用Reed-Muench 法计算各病毒的TCID50。

1.2.3 抗病毒活性评价 将100 TCID50的H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药病毒株与药物同时加入细胞中,各组均为2 个复孔,并设置不加药物的病毒对照组和正常细胞对照组。各组细胞于37℃培养22 h,采用间接免疫荧光的方法测定细胞培养液上清中病毒复制水平,实验采用流感病毒NP 蛋白的单克隆抗体特异性结合NP 蛋白,之后用荧光标记的二抗结合一抗,检测荧光信号的数量及强度。通过荧光信号的数量判断病毒复制的水平,观察儿童清咽解热口服液和利巴韦林对H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药株病毒增殖的影响。抑制率(%)=100-(样品孔数值-空白对照数值)/(病毒对照数值-空白对照数值)×100,利用Graphpad Prism 6 作图并计算

2 结果

2.1 药物对细胞的毒性测定 在MDCK 细胞上,儿童清咽解热口服液的CC0.1为0.85 mg/ml,利巴韦林的CC0.1＞73.26 μg/ml。见 表1,表2。CellTiter-GloTM免 疫荧光法测定结果与CPE 法一致。采用Graphpad Prism作图计算儿童清咽解热口服液的CC50为44.97 mg/ml。

表1 CPE 法观察药物对MDCK 细胞最大无毒浓度

表2 CellTiter-GloTM 免疫荧光法测定不同药物浓度作用的细胞活性及培养上清OD 值()

表2 CellTiter-GloTM 免疫荧光法测定不同药物浓度作用的细胞活性及培养上清OD 值()

注：细胞对照组OD 值为(1004118.33±55369.80)

2.2 病毒毒力测定结果 根据实验结果,采用CellTiter-GloTM免疫荧光法计算H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药株的TCID50值分别为107.83/ml 和108.0/ml,本实验采用病毒量为100 TCID50。

2.3 儿童清咽解热口服液抗病毒活性评价

2.3.1 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1、H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒的效果 在MDCK 细胞上采用药物和病毒同时加入的方式观察药物的抗病毒作用,37℃培养22 h 后培养液上清中高内涵荧光OD 值和抑制率见表3,表4。儿童清咽解热口服液OD 值明显低于病毒对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。说明儿童清咽解热口服液有较好的抗H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒作用。

表3 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 流感病毒效果()

表3 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 流感病毒效果()

注：病毒对照组OD 值为(11697.25±4586.81)

表4 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒效果()

表4 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒效果()

注：病毒对照组OD 值为(7553.75±1182.54)

2.3.2 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 的EC50和SI 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 的EC50为2.70 mg/ml,SI 为16.66,儿童清咽解热口服液和利巴韦林对流感病毒H1N1 的抑制作用和对MDCK 细胞的毒性结果见图1,表5。

表5 儿童清咽解热口服液对流感病毒H1N1 的抑制作用和对细胞的毒性作用

图1 儿童清咽解热口服液和利巴韦林对H1N1 病毒的抑制作用和对细胞的毒性作用

2.3.3 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒的EC50和SI 儿童清咽解热口服液体外抗H1N1奥司他韦耐药株流感病毒的EC50为2.29 mg/ml,SI 为19.63,儿童清咽解热口服液和利巴韦林对流感病毒H1N1 奥司他韦耐药株的具体抑制作用和对MDCK细胞的毒性结果见图2,表6。

表6 儿童清咽解热口服液对流感病毒H1N1 奥司他韦耐药株的抑制作用和对细胞的毒性作用

图2 儿童清咽解热口服液对H1N1 奥司他韦耐药株病毒的抑制作用和对细胞的毒性作用

3 讨论

儿童清咽解热口服液主要成分为柴胡、黄芩苷、紫花地丁、人工牛黄、苣荬菜、鱼腥草、芦根和赤小豆,具有清热解毒,消肿利咽的功效。小儿急性咽炎(急喉痹)属肺胃实热证,症见：发热,咽痛,咽部充血,或咳嗽,口渴等。现代药理学研究证实儿童清咽解热口服液具有抗炎、抗菌、抗病毒、调节机体免疫功能等作用［5-8］。临床上将其用于小儿急性咽炎的治疗,对小儿急性咽炎咽痛、大便干、咽红肿等症状有明显的改善作用,而且经济性好［9-12］。

本研究探讨了儿童清咽解热口服液采用中和的给药方式对H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒的抑制作用。研究通过CPE 和CellTiter-GloTM免疫荧光检测方法观察儿童清咽解热口服液对病毒感染细胞的保护作用。相较于传统细胞毒测定方法,CellTiter-GloTM免疫荧光法检测效率更高,更为可靠。CellTiter-GloTM免疫荧光法通过对三磷酸腺苷(ATP)进行定量测定来检测培养物中活细胞数目。有代谢活性细胞的呼吸作用和其他生命活动过程可以产生ATP,而发光过程中荧光素酶需要ATP 的参与,活的细胞就形成稳定辉光型信号,并在高内涵细胞分析仪被检测到。抗病毒活性检测通过采用间接免疫荧光的方法测定流感病毒蛋白表达水平来检测病毒的复制水平。实验采用流感病毒NP 蛋白的单克隆抗体特异性结合NP 蛋白,之后用荧光标记的二抗结合一抗,检测荧光信号的数量及强度,病毒结构蛋白的表达水平与病毒的复制水平呈正比,因此可以通过荧光信号的数量判断病毒复制的水平。实验结果表明,儿童清咽解热口服液采用中和给药方式对H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒均有显著抑制作用。儿童清咽解热口服液CC50为44.97 mg/ml,对H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药株流感病毒的EC50分别为2.70、2.29 mg/ml,在H1N1 和H1N1奥司他韦耐药株上的SI 分别为16.66 和19.63。一般认为SI＞1 时,药物具有低毒高活性［4］,结果显示儿童清咽解热口服液具有体外抗H1N1 和H1N1 奥司他韦耐药病毒株的作用,显示出较好的安全性及有效性。

急性咽炎是急性上呼吸道感染的一种,急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部急性炎症的总称,亦常用“感冒”、“鼻炎”、“急性鼻咽炎”、“急性咽炎”、“急性扁桃体炎”等名词诊断,统称为上呼吸道感染,是小儿最常见的急性感染性疾病。急性呼吸道感染的病原体以病毒为主,占90%以上,常见病毒包括鼻病毒、柯萨奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒。非典型病原体在呼吸道感染中所占比例也呈逐渐升高趋势,其中肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌等。常见细菌仅为原发性上呼吸道感染的10%左右,病原菌以β 溶血性链球菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌等为主。本项研究结果证实儿童清咽解热口服液不仅对引起急性上呼吸道感染的常见病毒株H1N1 有效,还对奥司他韦耐药H1N1 病毒株有效,为儿童清咽解热口服液临床上治疗小儿上呼吸道病毒感染性疾病提供了启示和指导。