生物信息学分析与分子对接紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎分析

朱 洁 王青华 赵丹丹

·论 著·

生物信息学分析与分子对接紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎分析

朱 洁 王青华 赵丹丹

浙江中医药大学附属湖州中医院药剂科，浙江湖州 313000

探讨紫英抗炎合剂治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎的作用机制。通过自研Python脚本在TCMSP数据库中筛选紫英抗炎合剂的活性成分和靶基因，并通过人类基因数据库GeneCards获得湿热瘀结型慢性盆腔炎的靶基因，使用CytoScape3.9.0构建“药物-成分-靶点”、“成分-通路”网络。将筛选到的关键靶基因导入STRING在线平台，建立蛋白与蛋白相互作用网络，并进行生物信息分析以研究其机制。最后通过AutoDockTools和AutoDock vina进行分子对接分析，并与医院现有的西药的结合度进行对比后应用PyMol可视化作图。①从紫英抗炎合剂中筛选出豆甾醇等59个中药有效活性成分，白细胞介素6、肿瘤坏死因子等72个关键基因；②生物信息分析结果显示，紫英抗炎合剂生物学过程和功能集中在调节炎症反应、细胞因子活性等；③生物信息分析信号通路显示，紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎主要涉及PI3K-Akt信号通路、NF-kB信号通路等；④分子对接结果显示紫英抗炎合剂中的重要活性成分与慢性盆腔炎的核心靶点结合较好，甚至优于阿奇霉素和头孢西丁，筛选出结合度好、有氢键形成的构象关系IL6-Stigmasterol进行可视化处理。以上研究为紫英抗炎合剂日后进一步探索提供了新思路，也为通过网络药理学、生物信息分析和分子对接的方法，发展医院的新制剂提供了新的研究途径。

湿热瘀结型慢性盆腔炎；中药复方；紫英抗炎合剂；生物信息分析；分子对接

盆腔炎是妇科常见的生殖系统疾病[1]，慢性盆腔炎患者常见症状有下腹部胀坠、腰骶部酸痛[2]。中医学理论认为，盆腔炎是由于正气亏损、湿热之邪内侵，化毒蓄积下焦而致气血瘀滞引起，瘀湿过甚而化为热，致病情缠绵不愈，中医辨证可将其分为气滞血瘀、湿热瘀阻等多种分型[3-5]。

紫英抗炎合剂为浙江中医药大学附属湖州中医院已故省名老中医朱承汉经验方，方中败酱草、紫花地丁等药均可起到清热解毒的效果，同时紫花地丁、乳香活血消肿，蒲公英散结，延胡索行气、止痛，多药共用奏清热解毒、活血化瘀、消肿止痛的功效，适用于湿热瘀结型盆腔炎。浙江中医药大学附属湖州中医院多年的临床应用和对照研究也证明，紫英抗炎合剂在治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎方面具有显著的疗效[6-9]。

随着大数据、网络药理学、生物信息分析、分子对接技术的发展，对药物的研究尤其是针对中药复方中存在的多成分、多靶点的研究有了新的探索方法。网络药理学、生物信息分析使用的数据库持续更新，分析精准；使用分子对接工具进行分子虚拟对接运算速度快，应用精度高，可以为中药复方成分的研究提供有力的参考依据。

本研究通过网络药理学结合生物信息分析，构建药物、成分、靶点、通路之间的关系网络，探讨紫英抗炎合剂的药物活性成分、潜在靶点、作用机制和相关信号通路，阐述紫英抗炎合剂治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎的作用机制。通过分子对接技术，并增加西药对照组进行对接，选取结合能高、有氢键形成并有较稳定构象的对接结果，在证实紫英抗炎合剂治疗疾病的优势方面具有指导意义，同时为治疗开辟新的思路。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件

①TCMSP中药系统药理学数据库与分析平台：https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php；②中国科学院上海有机化学研究所，化学专业数据库：http://www. organchem.csdb.cn.[1978-2021]；③蛋白质数据库UniProt：http://www.uniprot. org/uploadlists/；④人类基因数据库GeneCards：https://www.genecards.org；⑤STRINGVersion 11.5：https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bBrtGEVz6u1L&input_page_show_search=off；⑥Metascape平台：https://metascape.org/gp/index.html；⑦微生信平台：http://www.bioinformatics.com.cn/；⑧PubChem数据库：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/；⑨CTD比较毒理基因组学数据库：http://ctdbase.org/；⑩RCSB PDB蛋白数据库：https:// www.rcsb.org/；⑪DrugBank数据库：https://go.drugbank. com/；⑫CytoScape 3.9.0；⑬AutoDockTools 1.5.7；⑭PyMol；⑮AutoDock vina1.2.3，Draw Venn Diagram：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

1.2 方法

1.2.1 筛选紫英抗炎合剂有效活性成分及相关靶基因 通过自研Python脚本设置TCMSP参数“Ingredients”“Related Targets”、口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，批量输入关键词，自动筛选紫英抗炎合剂各药物活性成分及对应的靶基因数据。同时通过中国科学院上海有机化学研究所、化学专业数据库查找TCMSP中没有的药物，获取化学成分，并选择相同筛选条件，获取对应的靶基因数据，最后通过蛋白质数据库UniProt对数据进行校正。

1.2.2 获取慢性盆腔炎相关基因 在人类基因数据库GeneCards中以“Chronic pelvic inflammatory disease”搜索慢性盆腔炎相关基因。根据《中药新药临床研究指导原则》对于湿热瘀结型慢性盆腔炎的症状描述内容，以下腹痛、白带多、色黄质稠、腰骶痛、舌有瘀斑、苔腻、脉弦等继续搜索，得到的基因经过合并去重后，与之前得到的慢性盆腔炎基因一同录入Draw Venn Diagram网站，交集数据即研究所需湿热瘀结型慢性盆腔炎基因[10]。

1.2.3 紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎作用靶点筛选 将“败酱草”“蒲公英”“大血藤”“紫花地丁”“乳香”“延胡索”的药物靶点合并去重，与慢性盆腔炎的疾病靶点共同录入Draw Venn Diagram网站，绘制韦恩图后显示的两者交集即为紫英抗炎合剂潜在治疗靶点。

1.2.4 构建蛋白-蛋白相互作用网络 STRING平台中导入筛选出的紫英抗炎合剂靶点，构建蛋白相互作用网络。参数设置选项为“multiple proteins（多种蛋白质）”，蛋白种类为“homo sapiens”，相互作用阈值设定为高置信度“highconfidence>0.9”，隐藏游离蛋白，其他均默认，生成的PPI文件下载后导入CytoScape软件绘制成图。运用Cytoscape中“CytoHubba”插件中的多种算法结合“MCODE”插件筛选核心靶点，取交集基因，根据CTD数据库中疾病靶基因的inference score排名情况，综合考量后获得最终的核心靶点。

1.2.5 药物-成分-靶点网络构建 对比紫英抗炎合剂中成分靶点及慢性盆腔炎（湿热瘀结型）靶点，找出各项成分对应的靶点，整理文件数据并导入CytoScape软件构建网络图，即“药物-成分-靶点”网络。在网络中各项节点代表药物、靶点及化学成分，边代表每个节点之间相互的作用。

1.2.6 紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎的靶点功能与通路的富集分析 Metascape平台功能包括PPI网络结构、生物通路富集分析及基因注释。将潜在治疗靶点录入Metascape平台，选择物种种类为“homo sapiens”，设置<0.01，最小计数为3，富集因子值超过1.5，对生物学过程和代谢通路进行分析，同时将KEGG与GO数据结果保存后上传至微生信平台，并进行可视化构图。

1.2.7 重要活性成分与关键靶点的分子对接验证 将药物活性成分网络按度值排序，选择前5的成分从PubChem数据库搜索对应配体的结构。将与湿热瘀结型慢性盆腔炎相关的核心靶点作为对接的受体。在UniProt数据库中查找人类已验证的靶点受体蛋白ID，进入RCSB PDB蛋白数据库，选择分辨率最高的人源结构做为对应的蛋白受体结构；将受体蛋白文件导入PyMOL软件进行去除溶剂、改性残基等操作，然后利用AutoDockTools加氢、计算电荷，转换格式保存。通过AutoDockTools的Grid Box对活性口袋参数进行确定，使用vina分子对接，并应用“Analyze”中“Show Interations”查看氢键，最后选择结合能高、构象较好的结果导入Pymol进行可视化作图[11]。

在DrugBank数据库中搜索关键词“Chronic pelvic inflammatory disease”，获得用于治疗慢性盆腔炎的西药药物，并选取浙江中医药大学附属湖州中医院现有的品种从PubChem数据库获取对应的结构做为对照配体，与核心靶蛋白受体进行分子对接，并比较对接结果。

2 结果

2.1 紫英抗炎合剂有效活性成分和靶基因

TCMSP中筛选发现，“紫花地丁”没有相应结果，不能进行后续研究；通过中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库查找“蒲公英”获取化学成分，并在TCMSP中以OB≥30%和DL≥0.18为条件，筛选有效活性成分及对应的靶基因数据。

蛋白质数据库UniProt进行校正后得到败酱草、大血藤、蒲公英、乳香及延胡索靶基因分别有209个、46个、28个、12个、208个，合并去重后共得到中药靶基因237个。

2.2 湿热瘀结型慢性盆腔炎相关基因

在GeneCards数据库检索“Chronic pelvic inflammatory disease”，并通过中位数卡值、去重后共筛选出1936个慢性盆腔炎相关基因。检索下腹痛、白带多、色黄质稠、腰骶痛、舌有瘀斑、苔腻、脉弦为关键词搜索，合并去重后得到646个湿热瘀结型相关的基因，与慢性盆腔炎基因录入Draw Venn Diagram，得到两者交集并导出数据，即湿热瘀结型慢性盆腔炎基因共434个。

2.3 疾病—成分靶点

将紫英抗炎合剂各成分对应的靶点组内去重后，和疾病基因共同导入Draw Venn Diagram网站，绘制韦恩图，所得72个靶点即紫英抗炎合剂作用于湿热瘀结型慢性盆腔炎的潜在靶点，见图1。

图1 紫英抗炎合剂-湿热瘀结型慢性盆腔炎靶点韦恩图

2.4 PPI网络构建

将前述72个关键靶基因输入STRING，按照1.2.4进行参数设置，下载PPI.tsv文件后导入Cytoscape软件绘制PPI网络图，图中八边形节点代表靶点，靶点越大越深代表其在网络中涉及的生物功能越多，越重要，见图2。

运用Cytoscape中“CytoHubba”插件中的多种算法结合“MCODE”插件筛选核心靶点，取交集基因，见图3。结合CTD数据库中疾病靶基因的检索结果，根据inference score排名情况综合考量后获得最终的核心靶点为IL6、TNF。

2.5 药物-成分-靶点网络构建

将紫英抗炎合剂的5个药物、59种有效活性成分及72个关键靶点按要求整理成Network和Type文件后导入Cytoscape，构建“药物-成分-靶点”网络结构，见图4。

图2 蛋白质互作网络关系图

注：八边形代表靶点，颜色由深至浅、大小由大到小代表重要程度降低

图3 核心靶基因

图4 紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎药物-化学成分-靶点网络图

注：六边形代表药物，三角形代表化学成分，菱形代表靶点

该网络图包括136个节点，423条边，其中边代表相互关系，使用“Analyze Network”计算“degree”值，degree前5数据结果提示，“degree”值排名前5的化学成分为MOL000098槲皮素、MOL000006木犀草素、MOL000422山奈酚、MOL000449豆甾醇、MOL000358β-谷甾醇，此5种成分为紫英抗炎合剂治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎的主要成分。图中一个药物包含了多种成分，一种成分对应多个靶点，一个靶点又和不同的成分相对应，充分验证了紫英抗炎合剂做为一种中药复方制剂治疗慢性盆腔炎是通过多成分、多靶点协同作用进行。

2.6 Go功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.6.1 Go功能富集分析 通过将2.3中获取的靶点录入Metascape平台，选择物种种类为“homo sapiens”，设置<0.01，最小计数为3，富集因子>1.5，分析其主要的生物学过程与功能，共富集出1300个生物学过程（BP）、47个细胞成分（CC）、89个分子功能（MF），根据校正后值进行排序，BP、CC、MF三项各自选择前20、16、20个导入微生信进行柱状图展示，见图5。

紫英抗炎合剂主要参与的生物过程包括对细胞迁移的积极调节、细胞分化的负调节、调节上皮细胞增殖、调节平滑肌细胞增殖、对生长因子的反应、调节炎症、对细胞外刺激的反应等。

分子功能主要富集在细胞因子活性、DNA结合转录因子结合、生长因子结合、趋化因子受体结合、肿瘤坏死因子受体结合、磷酸蛋白结合、酶抑制剂活性等。

2.6.2 KEGG通路富集分析 通过将2.3中所得靶点录入Metascape平台，选择物种种类为“homo sapiens”，设置<0.01，最小计数为3，富集因子>1.5，分析其主要的信号通路，共获取143条通路，结合值对通路排序，选择排名前20的通路导入微生信进行气泡图展示，见图6。

图5 GO富集BP、CC、MF三合一柱形图

注：柱形高度由高到低代表涉及功能重要性依次降低

图6 KEGG通路气泡图

注：气泡由大到小、颜色由深到浅代表参与通路数量依次降低

紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎参与的信号通路包括癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB、甲状腺激素、VEGF、趋化因子信号通路、Th17细胞分化、细胞凋亡等。

将排名前20的通路和其作用相关的63个关键靶点导入CytoScape构建“通路-靶点”网络结构，见图7。

2.7 重要活性成分与关键靶点的分子对接验证

将筛选出的成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇作为配体，从PubChem数据库获取对应配体的结构。将2.4中获得的核心靶点蛋白IL6、TNF按1.2.7中所示方法选择分辨率最高的人源结构1ALU、5UUI做为对应的蛋白受体结构。应用AutoDockTools确定Grid Box获得活性口袋参数后，使用vina进行分子对接操作得到每种活性成分配体和受体蛋白之间的结合能，见表1。

图7 靶点-通路网络关系图

注：图中圆形代表通路，六边形代表靶点

配体和受体对接结合能越低表示分子间结合的越稳固，结合能≤-5.0kcal/mol时表示两者结合的较好，结合能≤-7.5kcal/mol时表示两者间结合的非常好[11,12]。紫英抗炎合剂中活性成分与关键靶点的各组对接结果均<-5.0kcal/mol，表明结合活性良好，紫英抗炎合剂的主要活性成分对慢性盆腔炎的核心靶点具有较强的关联性。使用“Analyze”中“Show Interations”查看氢键，最后选择结合能高、构象较好的结果Stigmasterol-IL6进行可视化处理，分子对接图和结合位点，见图8。

表1 紫英抗炎合剂重要活性成分与核心靶点对接结合能

图8 豆甾醇-IL6分子对接图

选取浙江中医药大学附属湖州中医院现有治疗慢性盆腔炎的品种Azithromycin、Cefoxitin，从PubChem数据库获取对应的结构，做为对照配体，和核心靶蛋白受体进行分子对接，见表2。紫英抗炎合剂中的几组结合能均低于对照的西药结合能，紫英抗炎合剂的主要活性成分对慢性盆腔炎的核心靶点的关联性可能优于西药。

表2 对照西药活性成分与核心靶点对接结合能

3 讨论

本研究应用网络药理学和生物信息分析的方法，分析了紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎时疾病-药物-成分-靶点之间的相关信息，进行梳理后构建关系网络，直观显示该复方制剂中各有效成分、制剂的核心成分和疾病靶点的互相作用，也展示了生物功能和信号通路之间等各种复杂的分子网络关系。

研究人员共筛选出活性成分59个，与疾病的交集靶点72个，GO富集出1300个生物学过程，89个分子功能，得到143条信号通路，验证了紫英抗炎合剂是由多种成分相互协同作用，对疾病通过多通路、多靶点进行调控和治疗。

通过研究发现，紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎的主要靶点作用于槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇上，分子对接结果显示以豆甾醇尤其突出，而豆甾醇同时存在于败酱草、蒲公英、延胡索中。多篇文献研究结果显示败酱草中发现的槲皮素、木犀草素、山奈酚均具有抗炎、抗病毒的生物活性[13-15]。同时有多项研究证实，木犀草素可以通过NF-kB等多个信号通路发挥其药理作用，有效改善IL6的生成[16-20]。β-谷甾醇、豆甾醇作为甾醇类化合物，具有抗肿瘤、抗炎的作用[21]。

总结研究数据发现，紫英抗炎合剂的关键靶点有TNF、IL6等。IL6、TNF被视为促炎因子，能刺激炎症介质的释放，引起组织损伤[22]。IL6不仅能激活中性粒细胞，还能加剧炎症介质的产生[23]。TNF是慢性盆腔炎炎症反应中的重要影响因子，细菌感染后TNF迅速升高，逐渐演变成慢性盆腔炎[24,25]。由于传统中药研究思路的影响，虽然临床已证实慢性盆腔炎是促炎和抗炎双因子共同作用的过程，但紫英抗炎合剂仍局限于最初的临床案例研究，后期停滞在只使用而未再挖掘的层面，致使文献中也没有紫英抗炎合剂对慢性盆腔炎患者血清影响的进一步深入研究。

KEGG分析发现富集程度较高的有PI3K-Akt信号通路、Th17细胞分化、NF-kB信号通路等多条与癌症、炎症相关的信号通路。其中TNF、IL6在以上几条通路中均有参与，后期将通过其他实验途径对紫英抗炎合剂治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎的主要信号通路进行分析和验证。

分子对接技术起源于20世纪80年代，可以从微观水平来分析结构，从而确定药物的生物利用度[26,27]。研究人员应用分子对接技术，将紫英抗炎合剂配体和慢性盆腔炎受体进行模拟对接，同构观察发现每一项对接的结合能均小于-5.0kcal/mol，一定程度上能说明紫英抗炎合剂与慢性盆腔炎作用靶点受体在结合蛋白方面较好；比较中西药组间结合能后发现，紫英抗炎合剂组结合能均低于头孢西丁组，绝大部分低于阿奇霉素组，因此，就此3个受体而言，紫英抗炎合剂同它们的对接结合程度要优于头孢西丁和阿奇霉素。

选择出结合能低并且结合状态佳的结构Stigmasterol-IL6留待做进一步的验证研究。

综上，紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎（湿热瘀结型）的靶点主要以消除炎症为主，即IL6与TNF。涉及的通路包括PI3K-Akt及Th17细胞分化等。其生物过程主要涉及调节炎症、蛋白磷酸化的积极调控等。本次研究通过分子对接方法、生物信息分析并结合中药复方网络药理学，从复方制剂的成分出发，由靶点到通路到对接模拟，逐步阐明了紫英抗炎合剂治疗慢性盆腔炎是通过多成分协作、多靶点结合、多通路调控而产生作用，为后续紫英抗炎合剂的继续研究带来了新的角度和方向，奠定深入研究的数据基础，也为医院未来新制剂的开发提供了新的方法和路径。

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Analysis of bioinformatics and molecular docking Ziying anti-inflammatory mixture in the treatment of chronic pelvic inflammatory disease

Department of Pharmacy, Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, University of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang, Huzhou 313000, China

To explore the mechanism of Ziying anti-inflammatory mixture in the treatment of damp-heat stasis chronic pelvic inflammatory disease.The active components and target genes of Ziying anti- inflammatory mixture were screened in TCMSP database by self-developed Python script, and the target genes of chronic pelvic inflammatory disease of damp-heat stasis type were obtained from the human gene database GeneCards. “Component-target” and “Component-pathway” networks. The screened key target genes were imported into the STRING online platform, a protein-protein interaction network was established, and bioinformatics analysis was performed to study its mechanism. Finally, the molecular docking analysis was carried out by AutoDockTools and AutoDock vina, and the binding degree of the existing western medicine in the hospital was compared with PyMol for visualization.A total of 59 active ingredients of traditional Chinese medicine such as stigmasterol, 72 key genes such as interleukin-6 and tumor necrosis factor were screened out from Ziying anti-inflammatory mixture; The functions focus on regulating inflammatory response, cytokine activity, etc.; Bioinformatics analysis of signaling pathways showed that the treatment of chronic pelvic inflammatory disease with Ziying anti-inflammatory mixture mainly involves PI3K-Akt signaling pathway, NF-kappa B signaling pathway, etc.; The important active components in Ziying anti-inflammatory mixture bind well to the core targets of chronic pelvic inflammatory disease, even better than azithromycin and cefoxitin. The conformational relationship IL6-Stigmasterol with good binding degree and hydrogen bond formation was screened out for visualization.The above research provides new ideas for further exploration of the preparation, and also provides a new research approach for the development of new preparations in hospitals through network pharmacology, bioinformatics analysis and molecular docking methods.

Chronic pelvic inflammatory disease of damp-heat stasis type; Traditional Chinese medicine compound; Ziying anti-inflammatory mixture; Bioinformatics analysis; Molecular docking

R285

A

1673-9701(2022)36-0006-08

朱洁，电子信箱：ZJ13819231548@163.com

（2022–07–04）

（2022–09–06）