三七凝胶治疗牙周炎的初步研究

刘 丽，李雅萍，王 娟，张 新，马 梅，白 晶，常 红，李建红，刘月娥

牙周炎主要是以牙龈的炎症和牙槽骨破坏为主的慢性感染性疾病，在我国35岁以上人群患病率高达96.80%[1]。牙周炎病因复杂，目前治疗手段包括基础治疗、药物治疗及手术治疗，但效果均不理想。牙周炎治疗的最终目的是消除牙周炎症，恢复牙周组织已丧失的结构和功能，因此局部药物治疗已成为牙周病基础治疗后的有效手段。牙周局部缓释制剂置入牙周袋后，其中的缓释药物成分会被逐步缓慢的释放，可直接作用于病变组织，保持局部有效的药物浓度，使用方便，从而达到治疗牙周炎的作用[2]。原位凝胶与传统的亲水凝胶不同，其是以黏稠的溶液状态存在，当药物注射后会立即在给药部位发生相的转变，形成半固态凝胶，其制备一般由有效药物和基质组成[3]。中药在口腔疾病的研究与治疗相对较少，其在调节免疫力、增强牙周组织的防御修复和再生能力有良好的效果。中药三七具有止血、散疲、消肿止痛功效，可保护心肌细胞、降血脂、抗血栓、增强免疫力、抗炎、抗纤维化、消除氧自由基等[4]。三七总皂苷对多种实验性模型有良好的抗炎作用，能对抗组胺、5-羟色胺等所致毛细血管通性增加及炎症组织前列环素的释放，抑制巨噬细胞受到炎症刺激和白介素的释放[5]。本研究将三七有效成分与聚丙烯酸树脂制备成缓释凝胶，通过牙周炎经典改良建模方法成功建模，并观察药物对大鼠牙周炎模型的治疗效果，为三七作为治疗牙周炎药物的临床应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：全自动高温高压灭菌锅(HV-50，Hirayama，Japan)、Micro-CT(Y.Cheetah机型，扫描电压90 kV，电流55 μA，扫描分辨率11 μm，像素尺寸1024×1024，德国)，CT图像重建(vgstudioMax 3.0版本软件，德国)。PGE2、TNF-α ELISA试剂盒(武汉博士德)，羟甲基纤维素钠(CMC)，P.g W83(四川大学)，三七(国大药房，经鉴定为三七)，3%戊巴比妥钠(上海国药集团化学试剂公司)，复方磺胺甲恶唑片(西安金花制药厂)，PBS液(Sigma，USA)。羟乙基纤维素HEC(天津爱勒易医药材料有限公司)，甘油(国药集团化学试剂有限公司)，聚丙烯酸树脂(Eudragit RS PO罗姆公司)，三乙酸甘油酯(北京精求化工有限责任公司)。

1.2 动物：SD大鼠30只，清洁级，雄性，体重(170±10)g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。实验过程及动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.3 方法

1.3.1 原位凝胶的制备：本研究通过药物浓度与药效的基础研究和前期试验基础及相关文献的参考得出三七缓释凝胶处方配比，见表1。

表1 三七缓释凝胶配比

具体配置方法：①取处方量的甘油三乙酸酯(保温35～45 ℃)，加入处方量的聚丙烯酸树脂(Eudragit RS)搅拌至溶解；②取处方量的甘油加热至90～100 ℃，在1 200 r/min搅拌速度下加入处方量的羟乙基纤维素，搅拌至溶解；③温度降至45～50 ℃，将三七提取物按照比例加入，以1 200 r/min搅拌直至药物溶解；④将得到的溶液在低速搅拌下(20～60 r/min)混合，45～50 ℃保温条件下搅拌(50～85 r/min)并均质(2 800 r/min)1.5～2 h即得。三七总提凝胶浅褐色具有一定的稠度，成非自由流动的凝胶状态，通针性好，离心稳定性较好，并采用60 CO辐照灭菌后进行微生物限度检查，照射剂量6 kGy，照射时间为12 h。

1.3.2 动物建模与干预

1.3.2.1 建模：将实验大鼠30只随机均分成2组，建模组25只，将大鼠用3%戊巴比妥钠按5 mL/kg体重腹腔注射麻醉后，通过丝线结扎右上第一磨牙联合龈沟底涂注牙周致病菌混合液Pg和Fn 80 μL；阴性对照组5只，在双侧上颌第一磨牙腭侧牙龈沟底涂注80 μL无菌PBS，每隔2 d重复1次，诱导实验性牙周炎4周，实验组和对照组均饲以软食。建模4周时，采集每只大鼠唾液，将滤纸条置于大鼠颊黏膜建模区及龈沟处遇阻力停60 s，剪碎放入EP管加入0.5 mL PBS充分匀浆，每只大鼠断尾取血1 mL，3 000 r/min离心取上清液，检测PGE2指标量，考察牙周炎的形成情况。

1.3.2.2 药物干预：将建模成功的25只大鼠随机分为6只阳性对照，每只牙周炎症部位1 mL生理盐水注射，2 d 1次；另外19只牙周炎症部位给予三七有效成分缓释凝胶涂注，2 d 1次共干预1周。药物治疗后1周后采集30只大鼠模型标本如下：①唾液采集同上；②血清采集以心脏穿刺取血法，每只大鼠采集全血约3 mL，室温下静置2 h 后，3 000r/min 离心15 min，收集并分装血清，按试剂盒说明书用ELISA检测PGE2、TNF-α；③处死实验大鼠后从腭中缝对上颌骨进行锐性分离牙龈组织和上颌骨，并将其在10%中性甲醛溶液固定。置于Micro-CT系统的检测试管内，540°扫描，扫描分辨率10.44 μm×10.44 μm，最后使用Cobra软件进行三维重建后，观察各组大鼠的牙槽骨吸收情况。

2 结果

2.1 大鼠的大体观察：建模4周后，建模组大鼠双侧上颌第一磨牙颊腭侧牙龈红肿，易出血，BI=4，PD为(2±0.2)mm，有松动，皮毛无光泽，进食减少，活动笨拙；对照组大鼠牙龈无红肿，无牙周袋，无松动，毛泽光亮，饮食饮水正常，活动正常。

2.2 ELISA检测结果：2组大鼠建模前后唾液、血液中PGE2的水平比较差异有统计学意义；大鼠药物干预前后唾液及血液中PGE2、TNF-α的水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2至表3。

表2 2组大鼠建模前后唾液、血液中PGE2检测结果比较

表3 2组大鼠药物干预前后唾液及血液中PGE2、TNF-α检测结果比较

2.3 Micro CT检测结果：Micro CT 图像显示，正常组牙槽嵴饱满(图1A，目录后)，无明显附着丧失，小梁致密排列有序；模型组(图1B,目录后)，牙周韧带增宽，硬骨板不连续，牙槽骨有垂直骨吸收，附着丧失明显，根分叉暴露；给药后(图1C，目录后)，牙槽骨破坏改善，牙槽嵴高度略有增加，附着丧失减少，根分叉暴露减少。

3 讨论

牙周炎本身是一种细菌感染性疾病，细菌及细菌毒素又可激发宿主的炎性免疫反应，PGE2、TNF-α、IL-8、IL-1β等既可促进结缔组织基质的降解，也可刺激牙槽骨的吸收，还可通过自分泌和旁分泌途径，引起炎症的加重和扩大，是牙周炎过程中产生的主要炎性细胞因子[6]。骨破坏是由宿主对微生物产生的免疫和炎症反应所介导，然而针对牙周病细菌的局部免疫反应打乱了骨形成和骨吸收的稳态平衡，从而导致骨丢失的机制建立[7]。原位凝胶给药系统是药剂学领域的一个研究热点，是一种新型的药物释放系统[8]，其制备简单，使用方便，具有组织相容性、生物降解性及生物粘附性，与黏膜组织亲和力强，能发挥良好的释药性能。实验性大鼠牙周炎动物模型的建立为进一步探讨和发现牙周病的病因和疾病的发生发展过程提供理论依据，为临床治疗建立必要的实验依据[9]。

本研究将筛选出的三七有效成分制备成中药牙周原位凝胶，应用于实验大鼠牙周炎模型并观察疗效，从牙周炎的临床症状、分子生物学、影像学等方面观察到了牙周炎的表现，结果提示通过经典的原位凝胶制备方法成功制备了三七牙周原位缓释凝胶；牙周炎是一种慢性炎症性疾病，牙周炎症期间可以产生许多细胞因子，其中PGE2是参与牙周炎骨破坏作用最经典的细胞因子，它在牙周炎的进展中发挥重要作用，可作为牙周炎的诊断指标之一[10-11]。建模前后 ELISA检测大鼠模型唾液、血液PGE2含量，经统计分析后可见建模组表达显著高于对照组。通过Micro CT 检测了建模组较正常对照组在上颌第一磨牙的腭侧和根分叉区观察到了明显的牙槽骨垂直丧失影像，口内观察到了明显的牙龈炎症，触碰易出血，有较深的牙周袋。本次实验从各个方面进行验证，均证明此次模型符合牙周炎的要求，说明建模成功。TNF-α可以激活牙周组织的保护性免疫反应[12]，大量的TNF-α可加速炎症反应以及激活骨组织的破坏，从而对宿主造成伤害[13]。FAGUNDES[14]等研究证实，TNF-α的出现与Pg密切相关，较高的炎性介质与进展性的临床破坏程度有关。本实验结果表明，药物干预后建模组PGE2、TNF-α水平明显高于正常组，治疗组的PGE2、TNF-α水平明显低于建模组。牙周炎的症状主要包括牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨丧失及牙齿的松动甚至脱落[15]。在本次研究中，药物干预组较建模组牙槽骨密度增高，且牙龈粉韧，牙周袋变浅，触碰不易出血。这些结果与其他相关研究基本一致。

通过动物实验的药效学观察结果说明，三七有效成分制备的牙周原位缓释凝胶对牙周炎的治疗有一定的疗效，具体作用机理以及剂量、药效评价、药物在人体用药的药效学药代学还有待于进一步研究探讨。本研究结果为进一步研制三七有效部位及用复方缓释凝胶治疗牙周炎有一定的理论和实验指导价值，有望研发出治疗牙周炎的中药新型制剂，从而为牙周炎临床防治提供新的方法。