环指蛋白187在乳癌组织中的表达及其临床意义

缪姗姗,纪涵青,吴琍

(青岛大学附属医院乳腺外科,山东 青岛 266003)

环指蛋白187(RNF187)是一种E3泛素-蛋白连接酶。它含有E3泛素连接酶的环结构域，因而具有E3泛素连接酶活性并可以促进底物泛素化，再通过MAP3K1通路应答生长因子信号。有研究表明，下调MAP3K1可以抑制食管癌和乳癌细胞的增殖[1-2]。RNF187被鉴定为一种共激活物，主要连接c-Jun和Ras信号。相关研究表明，多种癌基因如Ras、Bcr-Abl、Met和c-Fos传递的癌基因信号都依赖c-Jun的激活，RNF187通过c-Jun信号通路参与癌基因信号传导促进癌症进展[3-4]。RNF187被证实在肝癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌和骨肉瘤中过表达，可以诱导肿瘤细胞的上皮-间质转化[5-6]。然而，RNF187在乳癌中的表达及其临床意义尚不清楚。本研究旨在探讨RNF187在乳癌中的表达情况，并分析其表达与临床病理学特征的关系，为临床治疗提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择青岛大学附属医院2019 年 5月—2020年5月行乳癌改良根治术的女性病人52例，收集其乳癌组织和癌组织边缘5 cm以上的正常乳腺组织样本。病人纳入标准：①术前活检确诊为乳癌；②术前未接受新辅助治疗；③临床病理资料完整并同意接受手术治疗。排除标准：①有其他恶性肿瘤史或转移性乳癌病史的病人；②特殊类型乳癌、炎性乳癌等；③合并其他慢性疾病或不能接受手术治疗的病人。按TNM 国际分期标准，Ⅰ期28例，Ⅱ期22例，Ⅲ期2例。肿瘤直径0.8～4.5 cm，平均(1.8±0.4)cm。根据病人有无间质脉管癌栓发生，分为高风险组(有间质脉管癌栓)29例和低风险组(没有间质脉管癌栓)23例。本研究经医院伦理委员会批准，并与研究对象或其家属签署知情同意书。

1.2 主要试剂

所用TRizol总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser以及SYBR© Premix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)购自TaKaRa(宝生物)公司；ROX plus合成引物购自GENEWIZ公司；鼠抗人RNF187 抗体购自北京博奥森公司；DAB显色试剂盒购自Servicebio公司。

1.3 实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测RNF187 mRNA的表达情况

按照TRizol试剂盒说明书提取总 RNA，按照逆转录试剂盒说明将 RNA 反转录为 cDNA。使用20 ng cDNA、200 nmol/L正反向引物以及Taqman Master Mix(德国罗氏诊断公司)进行RNF187和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的PCR扩增。引物及其序列见表1。PCR在光循环机中进行45个周期，每个周期包括：95 ℃变性15 s，引物55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40 ℃冷却30 s。本检测方法以GAPDH 作为内参，RNF187mRNA 相对表达量用 2-△△Ct法计算。

表1 qRT-PCR引物及其序列

1.4 免疫组织化学SP法检测RNF187蛋白的表达

将标本固定、脱水、切片后，滴加兔抗人(1∶60)多克隆一抗，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温避光孵育30 min，DAB避光显色，冲洗后苏木精复染，透明，封片，观察RNF187蛋白表达情况。RNF187表达阳性呈棕黄颗粒染色，颜色越深表明表达越强；若未出现棕黄颗粒染色则为阴性。采用BI-2000图像分析系统，随机选取5个视野，检测阳性细胞平均积分光密度值，以平均积分光密度值≥2为高表达，<2为低表达。染色强度分为0～3级：0级，阴性染色；1级，弱阳性染色；2级，中度阳性染色；3级，强阳性染色。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 乳癌及癌旁正常组织中RNF187 mRNA的表达比较

乳癌组织中RNF187mRNA表达量为2.52±0.60，明显高于癌旁正常组织(0.67±0.04)，差异有显著性(t=2.887，P<0.05)。高风险组RNF187mRNA表达量为2.76±0.42,明显高于低风险组(0.88±0.07)，差异有显著性(t=3.676，P<0.05)。

2.2 乳癌及癌旁正常组织中RNF187表达比较

RNF187阳性染色主要定位于细胞的胞质及胞核中，以胞质为主(图1A、C)；乳癌细胞呈明显深染(图1B、C)，而癌旁正常组织RNF187呈淡染(图1A)。乳癌细胞RNF187高表达37例(71%)，低表达15例(29%)；相应的癌旁正常组织中RNF187高表达13例(25%)，低表达39例(75%)，差异有显著性(χ2=22.190，P<0.01)。高风险组RNF187高表达者23例(79%)，低风险组RNF187高表达者12例(52%)，差异有显著性(χ2=4.293，P<0.05)。

A：癌旁正常组织；B：乳癌组织低表达组；C：乳癌组织高表达组。SP染色，400倍。图1 乳癌及癌旁正常组织中RNF187的免疫组化检测

2.3 乳癌组织中RNF187表达与病人临床病理特征的关系

RNF187的表达与乳癌病人年龄、发病时间、月经情况、生育情况、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性率的关系差异无显著性(P>0.05)，与有无淋巴结转移、TNM分期、有无间质脉管癌栓有关(χ2=4.293，H=3.445～37.510，P<0.05)。见表2。

表2 乳癌病人RNF187表达与临床病理特征关系

3 讨 论

乳癌的复发和转移是导致乳癌病人预后不良的关键因素[7]。根据乳癌NCCN指南,淋巴结转移和脉管癌栓侵犯是乳癌病人不良预后的重要指标,也直接影响后续治疗方案的选择。调查显示,伴有淋巴结转移和瘤周脉管侵犯的乳癌病人总生存率远低于对照组。穆凌光等[8]研究显示，淋巴结转移阳性是乳癌改良根治术后复发转移的独立危险因素。目前，乳癌的具体发病机制尚未明确。泛素-蛋白酶体系统因能特异性地识别降解底物蛋白,在细胞周期调控、转录调控、细胞凋亡和细胞信号转导中发挥着重要的作用。蛋白泛素化过程由3种酶依次催化完成：E1泛素激活酶、E2泛素连接酶和E3泛素连接酶。E3泛素连接酶决定了泛素化底物的特异性，同时也是是肿瘤靶向治疗的有效靶标[9]。RNF187是具有N端RING结构域的RING型E3连接酶家族之一，具有E3泛素连接酶活性并可促进底物的泛素化，在DNA损伤修复中起着抑制性作用[10]。

已有研究表明，RNF187与细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤的发生密切相关[11]。过表达RNF187可诱导Wnt信号转导异常，并与Ras基因协同促进肿瘤生成。RNF187通过MAP3K1途径响应生长因子信号。MAP3K1属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，在细胞增殖过程中起重要作用，可与Ras直接反应参与Ras信号传导途径。MAP3K1基因缺陷小鼠乳癌的转移受到抑制[12]。相关研究表明，RNF187通过MAP3K1通路，作为Jun介导的基因激活的辅助激活物，参与多种恶性肿瘤的发生发展及侵袭转移[13]。RNF187过表达激活了Wnt和Ras通路，加速了结肠上皮瘤的发生[14]。高水平的RNF187增强了骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和增殖[15]。另有研究表明，上调RNF187表达明显增强了非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭和集落形成，高水平的RNF187主要通过激活有丝分裂原活化蛋白激酶和PI3K信号，通过诱导上皮细胞向间质转化和凋亡抵抗来促进非小细胞肺癌病情的进展[15];卵巢癌中高水平的RNF187表达与恶性表型显著相关，能促进卵巢癌的增殖和迁移，抑制卵巢癌的分化，RNF187的高表达与卵巢癌病人预后不良密切相关，是独立的预后因素[16-18]。

本文研究检测了乳癌细胞和癌旁正常组织中RNF187基因和蛋白的表达情况，结果显示，无论是在转录水平还是翻译水平，乳癌组织RNF187的表达均高于相应的邻近癌旁组织，提示乳癌组织中RNF187的高表达与异常的转录和翻译过程有关。本研究结果还显示，RNF187高表达与乳癌病人的侵袭性临床病理特征相关，如腋窝淋巴结转移、间质脉管癌栓、临床分期晚等，提示RNF187可能与乳癌预后不良密切相关。本文根据乳癌病人有无间质脉管癌栓的发生，将乳癌病人分为不同风险复发转移组进行分析，结果显示，高风险组(有腋窝淋巴结转移或临床中晚期)病人RNF187的表达显著高于低风险组(无腋窝淋巴结转移或临床早期)病人。提示RNF187的高表达可能与乳癌的侵袭转移及预后不良有关。

综上所述，乳癌组织中RNF187的高表达可能与复发、转移等不良预后有关，可能为乳癌的独立预后因素。对RNF187进行深入研究将有助于我们发现新的治疗靶标，在未来的乳癌治疗中发挥积极作用。