ADRB2和FCER1B基因多态性与壮族咳嗽变异性哮喘患儿治疗效果及肺功能改善情况的相关性▲

陆玉娇 杨月容 陈 宇 罗 柳 胡丽珊 米 佳

(南宁市第一人民医院儿科，广西南宁市 530021)

1989～2015年，中国哮喘监测地区0～14岁儿童的哮喘患病率为2.6%，且患病率呈上升趋势[1]。如果儿童时期哮喘久治不愈或治疗效果不佳，患儿的生长发育、学习、生活都会受到严重影响。咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性咳嗽为主要临床表现的一种哮喘表型[1]。CVA的发病原因复杂多样，近年来，遗传学和分子生物学的迅速发展促进了哮喘遗传学方面的研究。研究表明，肾上腺素能受体β2(adrenoceptor beta 2,ADRB2)、Ⅱ型Fcε受体(Fc epsilon receptor Ⅱ,FCER2)、白细胞介素(interleukin,IL)-18、IL-13等基因多态性与哮喘的发病有着密切关联[2-5]。其中，ADRB2基因单核苷酸多态性的改变主要包括第16位的精氨酸突变为甘氨酸(Arg16Gly)、第27位的谷氨酰胺突变为谷氨酸(Gln27Glu)、第34位的缬氨酸突变为蛋氨酸(Val34Met)等[6]。Mohamed-Hussein等[7]研究发现，ADRB2基因Arg16Gly和Gln27Glu位点的多态性与哮喘严重程度和患儿治疗反应有关。Jovicic等[8]的研究也表明，ADRB2基因Arg16Gly位点的多态性可能是哮喘严重程度和患儿对沙丁胺醇药物反应的决定因素。因此，ADRB2基因发生缺陷，会对哮喘严重程度和患儿的药物治疗反应产生一定的影响。此外，Ⅰ型Fcε受体β(Fc epsilon receptor Ⅰβ,FCER1B)是IgE的高亲和力受体，参与IgE介导的Ⅰ型超敏反应。该基因变异后可引起血清总IgE水平升高，使肥大细胞等释放炎性介质增多，从而导致哮喘的发生[9]。

由于遗传和环境因素在不同种族人群中起着不同的作用，因此国内外有关基因多态性与哮喘之间的关系的研究结论差异较大[10-11]。在国内，针对汉族哮喘患者的相关研究较为普遍，而针对壮族等少数民族哮喘患者的研究较少。此外，有研究显示，基因多态性对不同民族(汉族与壮族)人群疾病易感性的影响相差较大[12-13]。因此本研究选择ADRB2基因Arg16Gly位点和FCER1B基因的Glu237Gly位点，探究壮族1～6岁CVA患儿上述基因位点多态性与治疗效果和肺功能改善情况的相关性，为实现个体化用药方案提供参考依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2018年1月至2020年1月南宁市第一人民医院收治的壮族CVA患儿为研究对象，随访患儿的药物治疗效果及治疗3个月后的肺功能。纳入标准：(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[14]中有关CVA的诊断标准；(2)年龄1～6岁；(3)初次确诊，未接受过相关治疗；(4)患儿父母均为壮族(以身份证的信息为准)；(5)患儿家属同意参加本次研究，并签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他严重呼吸系统疾病，如重症肺炎、支气管肺发育不良、毛细支气管炎、喉炎等；(2)患有严重的感染性疾病；(3)心源性哮喘；(4)不耐受激素治疗；(5)未完成随访。最终纳入88例CVA患儿，包括男童41例、女童47例；患儿年龄1～6岁，其中1～<2岁8例(9.09%)，2～<3岁21例(23.86%)，3～<4岁29例(32.96%)，4～<5岁19例(21.59%)，5～6岁11例(12.50%)。本研究已通过我院医学伦理委员会的批准。

1.2 治疗方案 所有患儿均接受布地奈德粉吸入剂(AstraZeneca公司，规格：0.1 mg×200吸；200 μg/次，2次/d)联合孟鲁司特钠咀嚼片[默沙东(中国)有限公司，规格：0.1 g/片；10 mg/次，1次/d]治疗。相关研究表明CVA的治疗时间应≥8周[15]，因此本研究跟踪随访患儿治疗3个月后的治疗效果及肺功能。

1.3 治疗效果的判断 参考《临床疾病诊断与疗效判定标准》[16]评估治疗效果。治愈：治疗7 d内，患儿的临床症状及肺部体征消失，肺通气功能基本正常，3个月内未复发。好转：治疗7 d内，患儿的症状减轻，肺部哮喘音明显减少，肺功能好转，经过4周的治疗后症状消失，3个月内未见复发。无效：治疗3个月后症状无明显改善或症状加重。将治愈、好转的患儿纳入有效组，将治疗无效的患儿纳入无效组。

1.4 肺功能检查方法 对于<3岁的患儿，在其安静状态下(必要时给予镇静)行潮气呼吸肺功能检测，通过潮气呼吸流量-容积曲线来评估患儿的肺功能，记录潮气量、达峰时间比、达峰容积比、有效气道阻力、呼吸频率等参数；对于≥3岁的患儿，行常规肺通气功能检测，记录用力肺活量、第1秒用力呼气容积、第1秒用力呼气容积占肺活量比值、呼气峰流速、呼气中段流速、最大通气量等参数。参照相关文献[17]提供的肺功能正常范围，将治疗3个月后上述所有肺功能指标恢复至正常范围的患儿纳入肺功能正常组，其余患儿纳入肺功能异常组。

1.5 标本采集与基因多态性检测 (1)标本的采集：用含有乙二胺四乙酸抗凝剂的真空采血管抽取患儿治疗前空腹静脉血2 mL，4 ℃保存待检。(2)提取外周血基因组DNA：取静脉血2 mL，按照1 ∶5的比例加入双蒸水裂解8 min，放入离心机中，1 700 r/min离心5 min，去掉上清液。重复裂解1次，留取白细胞沉淀。加入0.5 mL的DNA细胞裂解液(含150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5%十二烷基磺酸钠)来悬浮白细胞沉淀。于悬浮后的溶液中加入20 μL蛋白酶K，将其置于65 ℃水浴锅中30 min，其间缓慢旋转5次；从水浴锅中取出悬浮后的溶液后，在室温下加入0.5 mL的苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液(上海金畔生物科技有限公司，批号：311-90151)，剧烈震荡混匀10 min，放入离心机中以8 000 r/min离心10 min，将得到的水相转移到新的离心管中。将1 mL的无水乙醇添加到水相中，混匀，放入离心机中以8 000 r/min离心3 min。用70%的乙醇将离心后得到的沉淀洗涤两次，干燥，用50 μL去离子水悬浮，得到DNA样品。(3)DNA浓度测定：使用Thermo Fisher Scientific公司Genesys 10 s紫外可见分光光度计测量260 nm和280 nm波长下的吸光度(A)，计算A260 nm/A280 nm，若A260 nm/A280 nm>1.8，则认为DNA样品纯度较高，可用于下一步的实验。(4)引物设计与合成：本研究主要设计两个基因位点进行扩增分析，分别为ADRB2基因的Arg16Gly位点rs1042713和FCER1B基因的Glu237Gly位点rs569108。在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库中检索rs1042713和rs569108的序列，根据Primer 5.0软件设计引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。(5)PCR扩增：用ADRB2 rs1042713和FCER1B rs569108的特异性引物进行PCR扩增。按下列体系配制PCR反应体系，包括0.6 μL的DNA模板、3 μL的10×Pfu缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)、0.6 μL的dNTP 混合物[10 mmol/L，天根生化科技(北京)有限公司，批号：CD117]、0.6 μL的正向引物(10 μmol/L)、0.6 μL的反向引物(10 μmol/L)、0.3 μL的Pfu DNA聚合酶[2.5 U/μL，天根生化科技(北京)有限公司，批号：EP101]、24.3 μL的双蒸水，总体积为30 μL。PCR反应步骤为预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环；总延伸72 ℃ 7 min。(6)基因型检测：PCR反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果分析ADRB2基因rs1042713位点和FCER1B基因rs569108位点的基因型。

表1 引物序列

1.6 统计学分析 采用Haploview 4.1软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。所有统计学检验采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 88例CAV患儿的ADRB2基因rs1042713位点和FCER1B基因rs569108位点的基因型及等位基因分布频率 ADRB2基因rs1042713位点有AA、AG和GG 3种基因型，以AG基因型最为常见，等位基因A的频率为52.84%，等位基因G的频率为47.16%。FCER1B基因rs569108位点有AA、AG和GG 3种基因型，以AA、AG基因型更为常见，等位基因A的频率为69.89%，等位基因G 的频率为30.11%。见表2。

表2 88例CAV患儿的ADRB2基因rs1042713位点和FCER1B基因rs569108位点的基因型及等位基因分布情况[n(%)]

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 ADRB2基因rs1042713位点、FCER1B基因rs569108位点的基因型实际频数与理论频数差异均无统计学意义(均P>0.05)，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。见表3。

表3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果[n(%)]

2.3 有效组与无效组患儿ADRB2基因rs1042713位点、FCER1B基因rs569108位点基因型分布情况的比较 药物治疗3个月后，治疗有效的患儿共67例(76.14%)，治疗无效的患儿共21例(23.86%)。两组患儿的ADRB2基因rs1042713位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，其中携带GG基因型患儿治疗无效的风险是携带AA/AG基因型患儿的4.833倍(P<0.05)。两组患儿的FCER1B基因rs569108位点基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 有效组与无效组患儿ADRB2基因rs1042713位点、FCER1B基因rs569108位点基因型分布情况的比较[n(%)]

2.4 肺功能正常组与肺功能异常组患儿ADRB2基因rs1042713位点、FCER1B基因rs569108位点基因型分布情况的比较 药物治疗3个月后，肺功能正常的患儿共52例(59.09%)，肺功能异常的患儿共36例(40.91%)。两组患儿的ADRB2基因rs1042713位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)，其中携带GG基因型患儿治疗后肺功能仍异常的风险是携带AA/AG基因型患儿的7.636倍(P<0.05)。两组患儿的FCER1B基因rs569108位点基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 肺功能正常组与肺功能异常组患儿ADRB2基因rs1042713、FCER1B基因rs569108位点基因型分布情况的比较[n(%)]

3 讨 论

哮喘在全球范围内的发病率较高，在不同国家中患有哮喘的人口比例为1%～18%，其发病受到环境因素的影响，还具有明显的遗传倾向，是一种复杂的多基因遗传病[18-19]。因此，哮喘的易感基因成为近年来的研究热点。CVA作为哮喘的特殊类型，是儿童慢性咳嗽的首要病因[20]。若儿童时期哮喘久治不愈或治疗效果不佳，患儿的生长发育可受到严重影响，因此分析CVA患儿的易感基因，对于制订治疗方案具有重要意义。

既往研究表明，ADRB2基因多态性与哮喘具有显著的相关性，其中ADRB2基因常见的多态性位点为Arg16Gly、Gln27Glu和Thr164Ile，本研究分析的 ADRB2基因rs1042713位点即为第一种。近年来，该基因位点多态性与哮喘之间的相关性是研究热点之一，但由于种族和年龄等的差异，研究结果存在一定差异。例如，Akparova等[21]在哈萨克人群中发现，ADRB2基因的Arg16Gly和Gln27Glu位点的单核苷酸多态性与哮喘具有显著相关性。而一项Meta分析结果显示，ADRB2基因Arg16Gly位点的多态性与中国汉族儿童哮喘的易感性无相关性，但Gln27Glu位点等位基因G突变可能是中国汉族儿童发生哮喘的保护因素[22]。Katsarou等[23]发现，欧洲东南部人群与西北部人群Arg16Gly位点的等位基因的分布截然不同。这些研究结果说明ADRB2基因多态性在不同种族间存在一定差异，但ADRB2基因的基因型在中国壮族CVA患儿中的分布情况，以及ADRB2基因多态性与壮族CVA患儿治疗效果及治疗后肺功能改善情况的相关性却无明确证据支持。

本研究共纳入88例壮族CVA患儿，ADRB2基因rs1042713位点有AA、AG和GG 3种基因型，不同治疗效果患儿之间ADRB2基因的基因型分布存在差异(P<0.05)，且携带GG基因型患儿治疗无效的风险是携带AA/AG基因型患儿的4.833倍(P<0.05)；此外，在治疗后不同肺功能检测结果患儿之间该基因位点的分布也存在差异，其中携带GG基因型患儿治疗后肺功能仍异常的风险是携带AA/AG基因型患儿的7.636倍(P<0.05)。这表明ADRB2基因rs1042713位点多态性可能与壮族CVA患儿的吸入性糖皮质激素治疗效果及治疗后肺功能改善情况密切相关。因此，对于携带ADRB2基因rs1042713位点GG基因型的壮族CVA患儿，可将治疗方案调整为吸入性糖皮质激素联合β2受体激动剂，以提高其治疗效果。

FCER1B编码 IgE 高亲和力受体β链，在哮喘的发病中起重要作用[24]。FCER1B基因Glu237Gly(谷氨酸237>甘氨酸237)位于11q13区域，本研究分析的rs569108位点即Glu237Gly。既往研究表明，Glu237Gly位点多态性与气道高反应性显著相关[25]。因此本研究探讨了该基因位点多态性与壮族CVA患儿治疗效果及治疗后肺功能改善情况的关系，结果显示，FCER1B基因rs569108位点有AA、AG和GG 3种基因型，其基因型在不同治疗效果患儿之间的分布并无差异(P>0.05)，在不同肺功能检测结果患儿之间的分布也无差异(P>0.05)。这提示FCER1B基因多态性可能与壮族CVA患儿的治疗效果及治疗后肺功能改善情况无显著相关。

综上所述，壮族CVA患儿的吸入性糖皮质激素治疗效果及治疗后肺功能改善情况可能与ADRB2基因rs1042713位点多态性密切相关，而与FCER1B基因rs569108位点多态性可能无关。本研究所得结论或可为壮族CVA患儿实现个体化用药方案提供药物基因组学的参考依据。