高效液相色谱法测定依法韦仑异构体含量*

2023-01-28张稳稳谭黎君刘小东郑曦孜

中国药业 2023年1期

张稳稳，谭黎君，刘小东，郑曦孜

（1.重庆医药高等专科学校药学院，重庆 401331；2.重庆希韦医药科技有限公司，重庆 400714；3.重庆市长寿区中医院，重庆 401220）

依法韦仑化学名为（4S）-6-氯-4-（环丙乙炔）-4-三氟甲基-苯并-1，4-二氢噁唑-2-酮［1］，是由美国Merck公司开发的非核苷类逆转录酶抑制剂，主要用于首次治疗人体免疫缺陷病毒1亚型（HIV-1）患者［2-5］，于1999年2月被美国食品药物管理局（FDA）批准上市，商品名为Sustiva＆reg或Stocrin＆reg。现有技术通常以对氯苯胺为起始原料，发生酰氯化反应，后保护氨基，得N-2，2-二甲基丙酰基对氯苯胺，所得产物与三氟乙酸乙酯反应后脱保护，与环丙乙炔、格林尼亚试剂反应，经手性诱导、2，3-二氯-5，6-二氢基苯醌（DDQ）环化、脱保护等步骤，最后环合得目标产物依法韦仑［6-16］。虽然工艺较详细，但合成过程中产生的对映异构体［（4R）-6-氯-4-（环丙乙炔）-4-三氟甲基-苯并-1，4-二氢噁唑-2-酮］不易分离，极大地影响了依法韦仑成品的质量。目前，尚未检索到依法韦仑异构体含量测定方法研究。本研究中建立了测定依法韦仑异构体含量的高效液相色谱法，方法学考察参考文献［17-18］，为准确测定依法韦仑异构体的含量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BT125D型电子分析天平（北京赛多利斯公司，精度为十万分之一）；LC-20A型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；UV-2600型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试药

依法韦仑对照品（批号为R038UO，含量为99.7%），依法韦仑异构体对照品（批号为R061SO，含量为99.7%），均购于United States Pharmacopoeia；依法韦仑样品（重庆希韦医药科技有限公司，批号分别为Y01，Y02，Y03）；正己烷、异丙醇、乙醇（色谱纯，德国默克公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax SB-Phenyl苯基柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），Chiralpak OD-H手性柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：正己烷-乙醇（97∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：35℃；进样量：20 µL；运行时间：40 min。分别取依法韦仑对照品100 mg和依法韦仑异构体对照品25 mg，置同一100 mL容量瓶中，加流动相溶解并定容，作为混合对照品溶液，在此色谱条件下分别进样测定，记录色谱图。依法韦仑及其异构体在此色谱条件下的分离度为1.5，依法韦仑色谱峰理论板数为15 728，拖尾因子为1.01。色谱图见图1。

1.依法韦仑异构体2.依法韦仑图1高效液相色谱图1.Isomer of efavirenz 2.EfavirenzFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

取依法韦仑异构体对照品25 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为0.25 mg/mL的对照品溶液。取依法韦仑样品100 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为1 mg/mL的供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取依法韦仑异构体对照品10.29 mg，精密称定，加流动相溶解并稀释成质量浓度分别为0.05，1.03，8.21，10.26，15.39，20.52 µg/mL的系列溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，µg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=15 064X+4 692.9（r=0.999 7，n=6）。结果表明，依法韦仑异构体质量浓度在0.05～20.52µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限确定：精密吸取线性关系考察项下溶液（质量浓度为0.05 µg/mL）作为定量限检测溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算其色谱峰峰高与噪声的比值信噪比（S/N），以S/N为10∶1时的响应浓度为定量限，并将定量限检测溶液连续进样6次，结果定量限为0.050 µg/mL。另取线性关系考察项下溶液（质量浓度为0.05 µg/mL）3 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相稀释并定容，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以S/N为3∶1时的响应浓度为检测限，结果检测限为0.015µg/mL。

中间精密度试验与重复性试验：取依法韦仑异构体对照品和样品（批号为Y01）各适量，精密称定，共6份，按2.1项下色谱条件分别进样测定；次日另换1人另取6份该批样品，同法配置并测定。结果中间精密度试验和重复性试验的RSD均为5.22%（n=6），表明仪器精密度良好，方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为Y01）100 mg，精密称定，共9份，分别置100 mL容量瓶中，加入80%，100%，120%浓度的2.2项下对照品溶液（质量浓度为0.25 mg/mL），各3份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性试验：分别考察不同流速（0.8，1.2 mL/min）和不同柱温（30，40℃）对检测结果的影响。结果分离度均大于1.5，依法韦仑异构体含量不低于0.11%，表明方法耐用性好。

2.4 依法韦仑异构体含量测定

取3批（批号分别为Y01，Y02，Y03）样品，各100 mg，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算依法韦仑异构体的含量。结果含量分别为0.11%，0.12%，0.11%，平均为0.11%。

3 讨论

3.1 色谱柱选择

考察了手性多聚物型、Daicel Chiralpak®IC键合型、纤维素-三［3，5-二甲苯基氨基甲酸酯］衍生物的Chiralpak OD-H柱等手性色谱柱，结果前两类色谱柱的分离度、理论板数、分离因子等参数存在缺陷，分离效果差，后者能有效分离依法韦仑及其异构体，分离度大于1.5，依法韦仑色谱峰理论板数为15 728，拖尾因子为1.01。故最终选择该型苯基柱联用手性色谱柱。

3.2 检测波长选择

分别取依法韦仑及其异构体对照品各适量，采用紫外可见-分光光度计分别于200～400 nm波长范围内扫描，结果显示依法韦仑及其异构体均在250 nm波长处有较大紫外吸收。故最终选择检测波长为250 nm。

3.3 流动相选择

考察了正己烷-异丙醇（90∶10，V/V）和正己烷-乙醇（90∶10，97∶3，V/V）流动相系统。流动相系统为正己烷-异丙醇时，依法韦仑异构体色谱峰峰形差，分离效果不佳；流动相系统为正己烷-乙醇（90∶10，V/V）时，分离度小于1.5；为正己烷-乙醇（97∶3，V/V）时，分离度为1.5，色谱峰峰形好。故最终选择流动相为正己烷-乙醇（97∶3，V/V）。