吸入七氟醚全身麻醉对早期糖尿病肾病大鼠肾足细胞的影响

陈，林信武，郑智祥

福建省老年医院（福建省立医院北院）麻醉科，福建福州 350003

糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病常见的并发症之一，主要发病原因是糖尿病病情长期得不到很好的控制。体内高血糖、高血压水平会不断损害肾脏血管，增加肾脏过滤血液的负荷，久而久之就会导致肾脏疾病。糖尿病肾病在早期主要是出现微量白蛋白尿，随着疾病的进展，蛋白尿会越来越多，并逐步发展到肾病综合征的范围，在后期甚至会影响肾功能，且很多患者在后期病情进展非常快，且可能会发展为尿毒症。糖尿病肾病的发病率是逐渐升高的，这与糖尿病、肾病、高血压等疾病的发生率逐年上升密切相关[1]。临床研究发现，七氟醚与二氧化氮吸附剂接触后，能够降解生成少量的化合物A[五氟异丙烯甲氟醚（PIFE，C4H2F60）]，此化合物对大鼠有剂量依赖性肾毒性，而经过相关报道表明，七氟醚全身麻醉对人体肾功能并不会产生影响[2]。基于此，本研究于2020年9月—2021年9月选取66只DN大鼠作为研究对象，分析吸入七氟醚全身麻醉后对肾足细胞的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

七氟醚（日本）、链脲霉素（streptozocin, STZ）（上海懋康生物科技有限公司，产品编号：MS1601-100MG，规格：100 mg）；罗氏罗康全活力型血糖仪（德国）；UAL浓度测定用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）（美国）；Datex Ohmeda 7100型麻醉机及Datex Ohmeda S/5监护仪（芬兰）[3]；兔抗小鼠nephrin、podocin、α-SMA抗体，鼠抗小鼠desmin单抗（Abcam，英国）；Biotin-labeled山羊抗大鼠IgG，山羊抗大鼠二抗包被（英国）；PRO-PREPTM蛋白质提取方案（韩国）；试剂盒（美国）；QuantiRect逆转录工具包使用试剂盒Qiagen[4]（优宁维生物科技有限公司）；ABI棱镜7700序列检测应用系统（赛默飞世尔科技有限公司）；PVDF微孔膜、SDS-PAGE电泳（均产自美国）[5]。

1.2 方法

1.2.1 制备糖尿病模型大鼠 选取Sprague-Dawley成年公大鼠（由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号：NO.211002300003081）66只，体质量为200～260 g。适应性饲养1周，室内温度保持在22～25℃，相对湿度65%～70%，期间供给充足的饲料和水[6]。在大鼠腹腔内注射53 mg/kg的STZ，注射完成后方可恢复正常饲养，72 h后在大鼠尾部取静脉血检测血糖，大鼠造模成功判定标准为血糖≥16.7 mmol/L。

1.2.2 分组及七氟醚吸入方法 糖尿病肾病大鼠模型以随机方式分成每组均为33只的模型组和七氟醚组。另选取33只大鼠记为空白对照组。参照七氟醚的使用方法使七氟醚组大鼠吸入3.4%的七氟醚进行全身麻醉，干预3 h，模型组及空白对照组大鼠同期吸入30%氧气3 h[7]。

1.2.3 尿液UAL和血液生化参数的测定 大鼠尿白蛋白（urinary albumin, UAL）需每天测定，采用全自动生化分析仪。同时，采集主动脉的血液，用血糖监测仪测量血糖（glucose, GLU），血标本在-80℃环境下储存。通过自动生化分析仪采集血清中天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase, AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、肌酐（creatinine, CR）及尿素 氮（blood urea nitrogen, BUN）[8]。

1.2.4 肾组织的染色 收集实验大鼠的肾脏，并进行离心清洗，待清洗完成后进行称重，清除肾表面皮质，随后冻结肾脏组织。根据肾盏将右肾均匀切割为2 mm厚的肾组织，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，之后切割成3 μm厚的样本进行苏木精和伊红染色（H&E）[9-11]。

1.2.5 RNA隔离和RT-PCR方法 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, CAPDH）作为内部参数，采用RT-PCR方法测定肾皮质nephrin、podocin、α-SMA和desmin mRNAs。试剂盒分离RNA。12 μl反应（100 ng cDNA、0.5 μl gene-specific正向与反向引物、7.5 μl QuantiTect逆转录工具包）。循环条件：初始模板在95℃变性4 min，并保持95℃持续20 s转变40周，调整至55℃并降火40 s，在持续升温达75℃时持续40 s。每个样本分为3份，分别进行荧光检测内部参数。GAPDH数量正常化后，按一定比例控制mRNA的平均结果绘制设计成图表[12-13]。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件处理数据。计量资料符合正态分布，以（±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型组和七氟醚组血液生化指标比较

模型组UAL、GLU、BUN、CR、AST、ALT水平低于七氟醚组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 模型组和七氟醚组DN大鼠血液生化指标比较 (±s)

表1 模型组和七氟醚组DN大鼠血液生化指标比较 (±s)

组别七氟醚组（n=33）模型组（n=33）t值P值UAL（mg/24 h）5.12±0.25 3.41±0.15 33.693＜0.001 GLU（mmol/L）11.22±1.37 8.53±0.96 9.237＜0.001 BUN（mmol/L）10.08±0.96 9.25±0.83 3.757＜0.001 CR（μmol/L）70.23±9.18 63.15±5.12 3.869＜0.001 AST（U/L）58.38±6.38 48.33±5.69 6.753＜0.001 ALT（U/L）61.83±6.25 52.77±4.32 6.850＜0.001

2.2 3组肾组织H&E染色后病理变化观察

肾组织经H&E染色后，通过光学显微镜观察肾组织病理变化，其中空白对照组肾脏组织未出现变化；模型组出现管变形及不完整的肾小球，同时肾小球体积增加，表明早期DN大鼠经七氟烷预处理后，采集的肾组织均有病理变化。见图1。

图1 DN早期大鼠肾组织H&E染色的病理变化（镜下放大100倍）

2.3 RT-PCR法检测模型组和七氟醚组肾皮质相关指标的定性表达

根据凝胶电泳条带提示，七氟醚组的nephrin和podocin明显减少，而α-SMA和desmin明显增多。七氟醚组与模型组相比，nephrin和podocin明显减少，而α-SMA和desmin明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 RT-PCR法检测各指标的mRNA定性结果

2.4 Western blotting法检测模型组和七氟醚组相关指标的定量表达

七氟醚组与模型组对比，nephrin和podocin明显增多，而α-SMA和desmin明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），研究过程中仍观察出七氟醚组的协同效应，同时结果与mRNA表达均一致，表明早期DN大鼠经七氟烷预处理后采集的标本中，肾足细胞各指标表达均有变化。见图3。

图3 western blotting法检测各指标的mRNA定量结果

3 讨论

当前我国经济不断发展，人民生活方式出现较大转变，不良生活习惯导致我国糖尿病发病率不断上升。胰岛素分泌异常是导致糖尿病的主要原因，患者临床表现为血糖升高，机体长期处于高血糖水平，同时会出现脂质代谢异常等不良情况。糖尿病患者若不及时治疗会使病情加重而引发多种并发症[14]。临床通过控制患者血糖水平治疗糖尿病，其凝血和抗凝血检测有明显改变，要尽早实施处理，否则会加重病情。因此要选择有效的诊断方式，对患者病情实施诊断，对治疗患者疾病具有重要意义。肾内科中最为常见的一种疾病便是肾病综合征，该疾病的病程比较长，极易与糖尿病、高血压和心血管等疾病产生关联性作用，且此疾病的发症类型较多、危害性较大，为患者生活质量带来严重不良影响。据相关实践报道表明，糖尿病肾病与患者血糖、血脂、血压水平有很大关联，而且患者在治疗期间极易产生相关并发症，所以加强对患者的治疗十分重要。

从功能的角度来看，DN属于严重的综合征，其临床特征在于肾小球病变及DM、UAL排泄增加。根据过往研究分析得出[15]，DN蛋白尿水平与分子结构变化有显著相关性，同时nephrin、podocin、α-SMA和desmin存在异常表达。徐锋等[16]发现肾小球足细胞上存在膜蛋白，在维持膜完整性方面有显著作用。相关部门研究表明nephin与DN在分布与表达方面存在相关性。Podocin是由肾小球内皮细胞和支持细胞合成，是一个主要带负电荷的肾小球蛋白，可以固定在肾小球足细胞顶膜，由于很多阴性变化并不粘附于其他物质，通常被认为是重要的正常分子，用以保持滤膜和足突细胞的标记[17]。α-SMA属于肌纤细胞蛋白，研究发现其主要表达在正常肾血管平滑肌细胞中，若出现在系膜、肾小管上皮细胞和其他固有细胞中，则表明上皮间充质病变发生转变。

有研究表明，可采用腹腔注射STZ液的方式建立糖尿病模型大鼠[18]。本研究故采用腹腔注射STZ液53 mg/kg建立糖尿病模型大鼠，24 h后取尾静脉血，检测血糖浓度，血糖浓度≥16.7 mmol/L时，表明模型大鼠造模成功。造模成功后3 d内，大鼠逐渐出现不良反应，随着高血糖持续升高，其临床病症与糖尿病症状相符，符合糖尿病病理特征。有研究表明，腹腔注射STZ液造模成功后，大鼠的肾足功能明显下降，其GLU浓度明显降低[19]。本研究基于此，对STZ液诱导糖尿病肾病造模成功后进行饲养的大鼠给予吸入七氟醚麻醉干预，然后评价nephrin、pdodin、α-SMA和desmin定性和定量的表达。根据本研究结果显示，两组大鼠24 h内进行GLU浓度结果的测定，七氟醚组的大鼠各项生化指标较模型组明显提高（P＜0.05），说明七氟醚对于糖尿病肾病的GLU浓度有着一定的影响。

糖尿病肾病发病机制为长期高血糖造成肾脏动脉硬化，肾小球损伤造成蛋白尿，晚期可以造成肾功能不全[20]。治疗时，首先要控制好血糖，同时血压血脂等与动脉硬化有关的因素也要有效进行控制。本研究表明，肾组织经H&E染色后，通过光学显微镜观察肾组织病理变化，其中空白对照组肾脏组织未出现变化；模型组出现管变形及不完整的肾小球，同时肾小球体积增加。RT-PCR法检测下，七氟醚组大鼠的α-SMA和desmin增多，而nephrin和podocin显著减少，而七氟醚组与模型组相比，nephrin和podocin明显减少，而α-SMA和desmin明显增多（P＜0.05）。Western blotting法检测下，七氟醚组与模型组对比，nephrin和podocin明显增多，而α-SMA和desmin明显减少（P＜0.05），但能够观察到七氟醚组的协同效应，但这些结果与mRNA表达均一致，表明七氟醚对大鼠蛋白中的mRNA产生影响。

综上所述，吸入七氟醚后模型大鼠蛋白中的mRNA明显升高，而这种影响与nephrin、podocin、α-SMA和desmin有关。