金丝桃苷对慢性心力衰竭大鼠心脏功能及自噬相关蛋白表达的影响

刘国星，杜见霞，刘秀红，杜亚军，但国梅，王 浩，董振松

（枣阳市第一人民医院心血管内科，湖北枣阳 441200）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多种心脏疾病的终末阶段，其发病率和病死率逐年上升，严重威胁人们的健康［1］。现代医疗技术不断发展，但CHF 的疗效依然欠佳。近年研究发现，细胞自噬在心力衰竭中发挥着重要作用［2］。Cao 等［3］报道可通过降低心肌细胞的自噬水平改善心脏功能。金丝桃苷是普遍存在于金丝桃科、藤黄科、葵科等果实中的一类黄酮醇苷类化合物，其结构为槲皮素-3-半乳糖苷。金丝桃苷被证实具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗心律失常、神经保护及心肌细胞保护等［4-6］。到目前为止，未见金丝桃苷对CHF 心肌细胞自噬功能方面相关报道。本研究以SD 大鼠为研究对象，探讨金丝桃苷对心力衰竭大鼠心脏功能的影响，并分析其自噬方面作用机制，为治疗慢性心力衰竭提供实验依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

金丝桃苷购自上海源叶生物科技有限公司；自噬检测试剂盒购自Sigma 公司；异丙肾上腺素、BCA试剂盒购自碧云天公司；Beclin-1、p62、微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）I、LC3-II、GAPDH 抗体购自Abcam公司。电泳和转膜系统购自Bio-Rad 公司；JEM-1400EX透射电镜购自日本电子株式会社；DG3022A酶标仪购自北京倍肯医疗器械有限公司；IE33 型超声心动仪购自上海创讯医疗器械有限公司。

1.2 实验动物

选用健康雄性SD 大鼠21 只，年龄2～3 个月，体质量为230～250 g，无特定病原体级，由山东大学实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK（鲁）20150011。大鼠于温度为（25±2）℃、相对湿度为30%～60%，于光照12 h/12 h 明暗交替的动物房中饲养。适应性喂养1 周后进行正式试验。所有的实验过程均已获得动物伦理委员会同意，实验过程符合3R原则。

1.3 动物分组、建模及给药

21 只雄性SD 大鼠随机分为两组，即假手术组（6 只）、造模组（15 只）。参照文献［7］采用腹主动脉缩窄手术建立CHF 大鼠模型，即将大鼠麻醉后仰面固定于操作台，剃去胸腹部毛发、消毒，逐层打开腹腔分离腹主动脉，置入6 号钝器针，用4-0 丝线穿过该段腹主动脉连同6 号钝器针和腹主动脉一起结扎后迅速拔出钝器针。缩窄腹主动脉至原来直径的60%～70%，缝合，行常规抗感染治疗。用超声心动图评价大鼠造模成功后（造模死亡3 只大鼠）再随机分为2 组：模型组（0.9%氯化钠溶液2 mL/kg）和治疗组。治疗组大鼠建模后，每日腹腔注射给药1 次［金丝桃苷30 mg/（kg·次）］，连续给药4 周。假手术组和模型组以0.9%氯化钠溶液代替。

1.4 采用超声心动图检查大鼠心肌功能

按照实验分组，各组大鼠于建模后4、8及12周行超声心动图检查，记录心动图指标：左心室射血分数（left ventricular ejection farction，LVEF）、左心室舒张末期室间隔厚度（interventricular septal diastole，IVSd）、左心室收缩末期室间隔厚度（inter⁃ventricular septal systole，IVSs）、左心室缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒张末期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall diastole，LVPWd）及收缩末期左心室后壁厚度（left ventricu⁃lar posterior wall systole，LVPWs）。具体操作：检查前称体质量，将大鼠麻醉后固定于解剖板上，用超声心动仪探测心脏结构及腹主动脉缩窄情况。

1.5 采用醋酸铀-硝酸铅双重染色观察心肌组织形态学改变

各组大鼠于建模后12 周处死大鼠，取左心室组织1 mm×1 mm×1 mm 大小浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered sa⁃line，PBS）漂洗后，行醋酸铀-硝酸铅双重染色，于透射电镜观察心肌组织形态学的改变。

1.6 采用Western blot 检测相关蛋白表达

取冻存大鼠心肌组织100 mg，用预冷的组织裂解液提取蛋白。取适量蛋白样品上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离后，应用电印迹转移的方法将蛋白质转至聚偏二氟乙烯膜上。加入一抗Beclin-1、p62、LC3I、LC3-II 4℃过夜，用TBST 缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭2 h 后，加入二抗室温孵育1 h，DAB 显色，采用Image J 分析软件测定条带吸光度（absor⁃bance，A）值，以GAPDH 表达作对照。

1.7 心肌细胞损伤模型的建立、分组及给药

按文献［8］方法提取原代心肌细胞，采用异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）建立心肌细胞损伤模型，即从SD 乳鼠中取心肌组织，用差速贴壁方法分离原代心肌细胞，种于24 孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的饱和湿度恒温培养箱培养48 h 后，分为4 组：对照组、ISO 模型组、金丝桃苷组、自噬抑制组。ISO 模型组、金丝桃苷组、自噬抑制组细胞分别用1 μmol/L ISO 刺激30 min 后，金丝桃苷组加入金丝桃苷（1 μmol/L），自噬抑制组加金丝桃苷（1 μmol/L）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（5 μmol/L），收集处理48 h后细胞进行免疫荧光染色。

1.8 免疫荧光染色检测心肌细胞自噬情况

取细胞，加氯喹（10 μmol/L）培养6 h，加mito⁃tracker 溶液（250 nmol/L）避光孵育3 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，用4%多聚甲醛避光固定30 min，PBS 洗涤，封闭液处理。加一抗LC3 4℃，避光孵育过夜，加Cy3 二抗避光孵育2 h，PBS洗涤后装片，聚焦显微镜下随机选取5个视野观察并拍照。采用Image J进行统计分析，计算单个细胞平均自噬体数（自噬体显黄色荧光）。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计学处理。数据以（）表示，多组间比较采用重复测量方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠超声心动图检测指标的结果

与假手术组相比，模型组和治疗组大鼠超声心动图检查指标LVEF、LVFS 降低，IVSs、LVPWs、IVSd 及LVPWd 明显升高，且建模后8 周，模型组与假手术组相比或者治疗组与假手术组相比，超声心动图检查各指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。建模后12 周，与模型组相比较，治疗组大鼠超声心动图指标LVEF、LVFS 明显升高（P＜0.05），IVSd、LVPWs、IVSs 和LVPWd 明显降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠超声心动图检查指标对比 ［n=6，±s］

表1 各组大鼠超声心动图检查指标对比 ［n=6，±s］

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，1）*P＜0.05

2.2 各组大鼠心肌组织形态学改变情况

假手术组大鼠心肌细胞结构清晰、规则，形态正常；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，结构模糊，细胞内有大量自噬空泡聚集，自噬体数目较多；治疗组大鼠心肌病理学改变较模型组大鼠有明显改善，自噬体数目减少，细胞内未见明显空泡，见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态学比较

2.3 各组大鼠心肌组织中自噬相关蛋白的表达水平

假手术组大鼠心肌组织中LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表达水平较低，p62 蛋白表达水平较高。造模后，模型组大鼠心肌组织中LC3II/LC3I比例、Beclin-1 蛋白表达水平升高（P＜0.05），p62蛋白表达水平降低（P＜0.05）；给药后，治疗组大鼠心肌组织中LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表达水平下降（P＜0.05），p62 蛋白表达水平增加（P＜0.05），见图2、表2。

图2 各组大鼠心肌组织中自噬相关蛋白的表达比较

表2 大鼠心肌组织中Beclin-1、p62 及LC3II/LC3I蛋白相对表达比较 ［n=6，±s］

表2 大鼠心肌组织中Beclin-1、p62 及LC3II/LC3I蛋白相对表达比较 ［n=6，±s］

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，1）*P＜0.05

2.4 各组心肌细胞自噬水平比较

对照组、ISO 模型组、金丝桃苷组及自噬抑制组细胞中自噬体数分别为（4.3± 2.02）个、（39.8 ±6.03）个、（15.3 ± 6.83）个及（4.79 ± 2.41）个。与对照组相比，ISO 模型组心肌细胞自噬体数显著增加（P＜0.05）。与ISO 模型组比较，金丝桃苷组及自噬抑制组自噬体数显著下降（P＜0.05）；自噬抑制组下降更明显，见图3。

图3 各组细胞免疫荧光染色检测心肌细胞自噬水平比较

3 讨论

自噬现象广泛存在于各种生物体的各类细胞中，通过降解异常蛋白质及受损的细胞器，维持细胞稳态。但过度的自噬会引起细胞稳态失衡，诱发疾病［9］。近年报道，心肌自噬功能紊乱在CHF 和心肌重构中起着至关重要的作用［10］。王晶晶等［8］报道千层纸素A 可通过影响心肌细胞的自噬来改善ISO 所诱导的大鼠CHF。

建模后4 周，与假手术组相比，模型组大鼠IVSs、LVPWs、IVSd 及LVPWd 指标明显升高（P＜0.05），两组LVEF、LVFS 指标差异无统计学意义（P＞0.05）；建模后8 周，模型组与假手术组相比，超声心动图检查各指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明大鼠持续性心肌肥厚，对心功能产生了影响；醋酸铀-硝酸铅双重染色显示模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，结构模糊，细胞内有大量自噬空泡聚集，自噬体数目较多。这提示，成功构建了CHF 大鼠模型。经金丝桃苷治疗后，治疗组大鼠LVEF、LVFS 升高（P＜0.05），IVSd、IVSs、LVPWs 和LVPWd 明显降低（P＜0.05）；大鼠心肌病理学改变较模型组大鼠有明显改善。这提示金丝桃苷可逆转心室肥厚，改善大鼠心脏功能。

LC3 是细胞自噬的标志蛋白，定位于自噬小体膜上，当自噬发生时大量表达为LC3Ⅱ，其表达水平常用来评估细胞自噬水平［11］。Weng 等报道［12］，大鼠在行腹主动脉缩窄手术后，LC3-Ⅱ、Beclin1及自噬相关基因5 等自噬标志物的表达显著增加。p62 蛋白是自噬的底物之一，是自噬性降解的重要指标［13］。Western blot 结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织中LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表达水平升高（P＜0.05），p62 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。说明模型组大鼠心肌细胞自噬功能紊乱，细胞内存在过度自噬现象，从而导致心肌细胞数量降低，造成心室壁变薄，影响心脏功能。这与醋酸铀-硝酸铅双重染色显示：模型组大鼠自噬体数目较多的结果一致。本研究发现金丝桃苷处理后可显著提高p62 蛋白表达水平，降低LC3II/LC3I 比例、Beclin-1 蛋白表达水平。提示金丝桃苷可通过抑制慢性心力衰竭模型大鼠心肌细胞自噬，减轻心力衰竭。

为了进一步证实金丝桃苷抑制心肌细胞自噬情况，采用新生大鼠心肌细胞体外建立心肌细胞损伤模型。免疫荧光染色显示，与正常组相比，ISO 模型组心肌细胞的自噬水平显著增加，金丝桃苷处理后细胞自噬水平降低；加入金丝桃苷和自噬抑制剂3-MA 后，进一步抑制了细胞自噬水平。以上结果提示金丝桃苷可体外抑制心肌细胞发生自噬。

金丝桃苷有多种生物学活性，郭晓等［14］报道金丝桃苷对心力衰竭大鼠肝纤维化有抑制作用。杨永康等［15］报道金丝桃苷可通过调节自噬减轻心肌梗死小鼠心脏及胸主动脉的损伤。刘不悔等［16］报道金丝桃苷调控AMPK-ULK1 介导自噬，可改善D-半乳糖诱导肾脏衰老与损伤的作用。金丝桃苷抑制心肌细胞自噬的信号通路尚不清楚。Harder等［17］报道心肌细胞自噬与AKT1-RPS6KB1 信号通过相关。Jun 等［18］报道雷帕霉素通过抑制MEK/ERK 信号通路影响LC3-II，Beclin-1、Mcl-1 和p62的表达。Xiao 等［19］报道葫芦素B 能通过激活AktmTOR-FoxO3a 信号通路激活自噬。下一步我们将对金丝桃苷抑制心肌细胞自噬的信号通路进行深入研究。

综上所述，金丝桃苷可通过抑制慢性心力衰竭大鼠心肌细胞自噬，改善心脏的结构及其功能，发挥对心力衰竭的治疗作用。但其抑制心肌细胞自噬的信号通路尚不清楚，需进一步深入研究。