壳聚糖酶及其应用研究新进展

孙亚男，张付云

（大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023）

高效、高附加值地利用丰富的可再生生物质资源对可持续生物经济至关重要，是现代社会的主要目标[1]。几丁质是第二大天然有机可再生资源，广泛分布于生物体内[2]。壳聚糖是几丁质的脱乙酰化产物[3]，具有多种生物活性，其分子量大、水溶性差，极大地限制了其应用和商业化发展[4]。相比之下，壳寡糖（Chitosanoligosaccharide/Chitooligosaccharide，COS）具有较低的分子量和黏度，以及更好的水溶性，在一些研究中，COS 表现出更好的抗真菌和抗病毒活性，以及促进植物生长的能力等[5-6]。

COS 是壳聚糖的降解产物，是唯一带正电荷的天然低聚糖。COS 可以通过化学、物理和酶降解制备[7]。酶法与其他2 种方法相比具有反应条件温和、产率高、选择性好、可控性和重现性好、对环境有益等优点。具有特殊性质的酶在工业生产中受到青睐。由于聚合度（DP）直接影响COS 的生物活性，因此对壳聚糖酶的研究至关重要，对酶的来源、酶学性质及应用等方面进行概述。

1 天然壳聚糖酶来源

近年来，对细菌来源的壳聚糖酶研究颇多，包括芽孢杆菌属（Bacillus sp.），沙雷氏菌属（Serratia sp.），链霉菌属（Streptomyces sp.），类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.），其中Bacillus sp.的来源最多。除了这些常见的菌种，来源于新菌种的壳聚糖酶逐渐被研究者熟知。Ma Qinyuan 等人[8]从多个城市采集了土壤样品并利用颜色指示剂和酶活的跟踪测定进行了2 次筛选，发现R.equiF6 表现出最大活性，其菌落呈现淡粉色、圆形、光滑、不透明、发亮和黏液状。生理、生化和16S rDNA 序列分析得出F6 菌株被归类为红球菌属与几种马红球菌菌株具有100%的同源性。王琦等人[9]克隆了来源于Butyrivibrio sp.MC2013 编码的壳聚糖酶基因序列并命名为BUT，其与其他GH46 家族的壳聚糖酶相似度最高达59%且无分支出现。Qin Zhen 等人[10]从Gynuella sunshinyiiYC6258 基因组中鉴定GH46 家族假设蛋白基因并合成，BLAST 比对发现GsCsn46A 氨基酸序列与Bacillus nakamurai表达壳聚糖酶同源性最高且是具有GH46 家族催化结构域的单一模块化蛋白。Wang Yanxin 等人[11]利用Aquabacterium sp.A7-Y 基因组克隆出新的属于GH5 家族的内切壳聚糖酶——AqCoA，其与来自Polyangium brachysporum的GH5 家族纤维素酶具有高度的序列相似性。此外，通过挖掘或已知的方式也可获得壳聚糖酶。Yang Guosong 等人[12]通过使用BLASTP 程序和NCBI 数据库挖掘序列数据得到了来自Bacilus sp.MD-5 的csn-bac 基因。Luo Sa等人[13]利用已知序列的B.Amyloliquefaciens克隆出BaCsn46B 基因。Cui Dandan 等人[14]利用B.atrophaeusBSS 序列克隆出属于GH46 家族的Csn-SH 酶。

相比于细菌，真菌来源的壳聚糖酶较少，其作用机制和结构鲜有报道，原因是真菌来源的壳聚糖酶活性低于来源于细菌的。Qu Tianle 等人[15]从曲酱油的孢子中分离出来A.oryzae并在PDB 琼脂平板中大量培养，提取出总RNA 后获得的cDNA 克隆出一个新的GH20 家族β-N-乙酰己糖胺酶基因-AoNagase 基因，但其折叠方式不同于GH20 家族其他成员。Gleb E.Aktuganov 等人[16]通过筛选壳聚糖降解微生物分离出真菌菌株IB-37-2A，通过BLAST 比对和构建的系统发育树显示出与P.janthinellum进化枝中包含的几种青霉属物种的最大同源性。

除了从菌株中获得降解壳聚糖的基因，还有从基因组文库中挖掘降解壳聚糖的基因。Guan Feifei等人[17]从海洋宏基因组中筛选出CDA20 和CHIS5，分别属于CE4_SF 超家族和Glyco_hydro_46 家族，二者与ChbG/HPNK 家族脱乙酰基酶和来自Sphaerisporangium albumin的壳聚糖酶有高同源性且协同作用于壳聚糖。

2 壳聚糖酶酶学性质

聚糖酶的最适温度主要在30～60 ℃。Qin Zhen等人[10]和Sun Huihui 等人[18]异源表达了嗜冷性壳聚糖酶，分别为GsCsn46A 和Csn-CAP，它们分别在15 ℃和20 ℃表现出70%和86%的最大活性。Qu Tianle等人[15]和Jiang Zhenqiang 等人[19]异源表达分别得到了嗜热性壳聚糖酶-AoNagase 和PbCsn8，它们的最适温度分别高达65 ℃和70 ℃。热稳定性高的壳聚糖酶因其众多的优势，使得在工业生产中受到极大关注，但相关方面的报道较少。Chen X 等人[20]克隆了来源于Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶基因并在毕赤酵母GS115 中高效表达，最终得到热稳定性极高的新壳聚糖酶，对其特性研究发现在80，90，100 ℃的半衰期分别为2.5，1.0 h，30 min。

壳聚糖酶最适pH 值为4.0～8.0。Guo Na 等人[21]克隆Streptomyces albolongusATCC 27414 基因并异源表达得到了Csn21c，其最适pH 值为8.0，属于碱性酶。Zheng Qiuling 等人[22]得到了新的壳聚糖酶-CsnS，其最适pH 值为5.8，为偏酸性的酶。

金属离子会对改造后的壳聚糖酶活性产生影响。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+会促进壳聚糖酶降解壳聚糖，K+、Fe2+、Hg2+、Ni2+会抑制壳聚糖酶降解壳聚糖。Huang Zhen 等人[23]对壳聚糖酶celA1805的特性研究发现，1 mmol/L Ni2+使酶活性增加到111.2%，而Mn2+使活性受到了抑制。

3 提高酶活性方法

野生菌株表达的壳聚糖酶因其酶活性和稳定性不高而不能广泛使用。近年来，许多文献从不同的方向报道了不同的方法以提高酶活性和稳定性。

首先，从分子角度对野生菌株的基因进行改变。张朝正等人[24]使用常温常压等离子体（ARTP）诱变蜡状芽孢杆菌并筛选壳聚糖酶活性提高的菌株，试验结果表明此方法可以筛选到酶活性提高13.19%的突变菌株且酶活稳定性波动不大，仅在5%之内。该方法不改变菌落形态，但改变菌株的个体形态而且当诱变时间达到60 s 会造成蜡状芽孢杆菌90%以上的致死率。程功等人[25-26]使用毕赤酵母偏好的密码子优化了环状芽胞杆菌株MH-K1 编码壳聚糖酶的基因序列，以使毕赤酵母高效表达壳聚糖酶。也使用该方法优化了解淀粉芽孢杆菌株FZB42 编码壳聚糖酶的基因序列并在毕赤酵母中高效表达，酶解壳聚糖的结果表明壳寡糖的末端结构为氨基葡萄糖。

其次，优化酶解反应条件。Li Meng 等人[27]采用过氧化氢预处理分散在去离子水中的壳聚糖粉末，以快速降低壳聚糖溶液的黏度，从而使壳聚糖溶解更多。使用此方法通过补料分批壳聚糖成功制备了高浓度（9%，W/V）的壳聚糖溶液。Nur Rokhati 等人[28]使用低浓度的吐温80 提高了壳聚糖的水解速率且水解时间在24 h 之内。

再次，优化培养条件以提高壳聚糖酶活性。毛贵珠等人[29]对鹿皮色曲霉产壳聚糖酶条件进行了优化，确定了培养基成分：胶体壳聚糖1.5%，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，发酵周期为96 h，该菌株产壳聚糖酶活性是优化前的2.36 倍。王俊芳等人[30]经紫外和微波诱变枯草芽孢杆菌后选取了高产酶菌株并优化了培养基成分和培养条件，研究表明培养基成分为果糖1.3%，胶体壳聚糖0.5%，酵母粉2.0%，MgSO4·7H2O 0.3%和培养条件为初始pH 值7.2，温度28 ℃，转速200 r/min 能得到酶活比优化前提高6.9 倍的壳聚糖酶。熊妍妍等人[31]利用冷源等离子体诱变了鹿皮曲霉ZJOU-AC1，得到了酶活力提高了50.7%的壳聚糖酶并确定了最佳发酵条件为温度30 ℃，初始pH 值6.0，发酵时间80 h，接种量3%。

4 壳聚糖酶的应用

海产品产业的发展使得虾、蟹等甲壳类动物大量消费，全球产生了高达几吨的贝类废物。贝类废物富含几丁质等有价值的副产物。然而使用化学方法处理会对生态系统有害，使得酶法降解发挥了重要作用。Gincy Marina Mathew 等人[32]总结了包括壳聚糖酶在内各种酶对副产物的降解。贝类废物，如虾（对虾、虾、龙虾、南极磷虾）壳、蟹壳，首先使用商业酶，如碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶产生者（如杆菌属）进行脱蛋白作用产生几丁质，几丁质分别被几丁质酶、甲壳素脱乙酰酶降解为壳寡糖（COS）、壳聚糖。壳聚糖和壳寡糖分别被壳聚糖酶、甲壳素低聚糖脱乙酰酶（COD）降解为部分乙酰化的低壳寡糖（paCOS）。

植物抗病研究一直是研究热点，使用生物方法不仅可以有效提高植物对病原菌的抗性，还可以起到保护生态环境的作用。来源于Chromobacterium violaceumATCC 12472 的壳聚糖酶-CvCsn46 产生的壳聚糖寡聚体抑制拟南芥的菌丝体生长，显著减少菌丝体延伸并诱导菌丝形态改变[33]。

5 结语

壳寡糖具有分子量小、易溶于水的特点且因其的多种生理活性，在许多领域应用广泛，尤其在食品和医药领域。壳聚糖通过酶法降解为壳寡糖一直是研究热点，而壳聚糖酶作为高效降解壳聚糖的酶备受关注。壳聚糖酶在各个领域的应用大部分决定于高活性酶的开发及成本[34]。野生菌株表达壳聚糖酶因产量低、活性低、来源有限、稳定性差而阻碍其生产及商品化应用。所以，一方面继续寻找合适的新野生菌株以作为起点；另一方面深入研究壳聚糖酶结构与功能的关系，从宏观和分子水平对野生菌株的壳聚糖酶进行定向化处理，从而产生高活性和稳定性的新壳聚糖酶，以符合生产生活需求。