双光子钙成像技术在啮齿类动物前边缘皮层中的应用研究进展

赵心愿，杨 洋，孙伟铭a,,e，贺彬峻，赵 红，冯 珍，马朝林

(南昌大学a.第一附属医院康复医学科； b.第一临床医学院2019级； c.生命科学学院；d.生命科学研究院； e.第一临床医学院康复医学教研室，南昌 330006)

钙离子(Ca2+)是生物体内最重要的信使之一，可产生多种细胞内信号控制神经元的关键功能[1]。细胞钙信号与神经系统内各种细胞的兴奋性、细胞通讯、递质释放、突触可塑性以及基因转录等生理、病理过程相关，监测细胞内钙信号变化有助于研究钙依赖的生理过程以及神经活动[2]。以往细胞内Ca2+检测方法主要是电生理技术，这项技术存在一些缺点，特别表现在长时间记录细胞活动时，电生理记录使用的电极会随着时间改变位置，即发生电极漂移，导致电极无法持续监测特定细胞的信号[3]。细胞内钙浓度变化能产生可被光学方法有效检测到的信号，钙成像技术利用这一特点，通过将钙离子指标与适当的光学成像技术相结合，可以在体外如神经元培养或脑切片，以及在动物模型的体内、脑内监测钙离子变化[4]。目前较常见的钙成像技术包括单光子钙成像技术、双光子钙成像技术、光纤记录技术和深脑显微钙成像技术等。双光子钙成像能在活体条件下对特定细胞中钙变化的时空动力学进行测量，实现在深层组织细胞水平上的形态和生理学监测，是更理想的研究工具[2]。

人类背外侧前额叶(dorsolateral PFC,dlPFC)负责认知、情感和感觉处理等多种重要功能。大多数关于前额叶皮层认知功能的理论都来自于对人类和非人灵长类动物的研究，有待在啮齿类动物中进行转化。dlPFC怎样为灵长类动物提供独特的心智能力的问题，也需要在不同物种之间进行比较性的研究[5]。与人类dlPFC功能相似的啮齿动物前边缘皮层(prelimbic cortex,PrL)虽被广泛研究，但在活体动物模型上长时程、小创伤和精准的监测实施较少，应用双光子钙成像技术可以对该皮层中神经功能机制继续深入的探究。 可见，应用双光子钙成像技术监测啮齿动物不同疾病模型或特定行为过程中PrL区细胞钙信号，分析其病理、生理过程，利于丰富有关人类dlPFC功能的研究。本文全面综述了双光子钙成像技术在啮齿动物PrL脑区的活动和功能机制研究中的应用。

1 双光子钙成像技术概述

钙成像技术能够可视化和定量检测细胞内的钙信号。钙成像应用于神经系统时，可根据实验要求来选择合适的钙指示剂、不同染料负载技术以及体外或体内钙成像设备。钙成像技术的发展主要包括钙传感器以及其相应仪器的发展和不断改进[1]。其主要的进展是在1990年DENK等[6-7]引入双光子显微镜，并将其用于神经系统的钙成像。

近年来，双光子钙成像技术已成为探究皮层神经元功能的一种常用方法。双光子显微镜系统主要由激光发射器、光束扩展器、二向色镜、物镜、探测系统、数据采集系统组成。主要过程是激光发射器发出激光，经过光束扩展器的调整被转换成对称均匀的平行光束，光束透过二向色镜，经过物镜汇聚到皮层目标区域，激发后的皮层目标区域发出相应荧光，再通过二向色镜反射到探测系统，最终探测到的信号由数据采集系统收集[3]。双光子钙成像能在单细胞甚至突触水平来研究神经元的钙活动，且其大范围的细胞分辨率成像能够同时记录数百个细胞[2]。它使一系列关于啮齿类动物的神经科学研究成为可能，如分析皮层之间的功能连接、皮层对各种感觉刺激的反应、行为过程中的神经活动、神经血管耦合以及轴突结构和功能等诸多研究[8]。目前小动物双光子活体成像在神经科学、神经药理学、肿瘤治疗、免疫学、干细胞应用等领域广泛应用[9]。

2 PrL脑区

人类前额皮层(Prefrontal cortex,PFC)指初级运动皮层和次级运动皮层以外的全部额叶皮层。许多神经成像研究关注于人类前额叶皮层的功能定位和划分，其中dlPFC、背内侧(dorsolateral prefrontal cortex，dmPFC)、腹内侧(ventromedial prefrontal cortex，vmPFC)和眶额叶前部皮质(orbital prefrontal cortex,OFC)是常见的功能分区[5]。dlPFC的功能通常与自上而下调节的维持和调节以及驱动适当的行为反应有关，它在注意力、价值编码、工作记忆、创造力、决策和情绪调节等认知过程中发挥重要作用[10]。

啮齿动物PFC由多个子区域组成，具有明显的连通性和功能。内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex，mPFC)是一个被广泛研究的大脑区域，它与其他脑区有着广泛而复杂的联系。其中，PrL是mPFC的关键脑区，与动机、注意和奖励相关等信息加工密切相关[11]。目前，PrL的划分和术语名称存在差异，VAN DE WERD等[12]在Paxinos和Franklin定义的OFC中发现了下边缘皮层(infralimbic cortex，IL)和PrL。此外，CARLÉN[5]还将部分前边缘皮层置于Paxinos和Franklin定义的扣带皮层2区(cingulate cortex 2，Cg2)。从功能上看,啮齿类动物的PrL与灵长类动物的dlPFC功能相似[11]，可大致对应人类Brodmann分区系统中32区[13]。灵长类动物dlPFC通过32区与25区进行交流以平衡理智与感情[14]。对啮齿动物PrL深入研究有利于进一步了解人类背外侧前额叶的神经机制。

3 双光子钙成像在PrL区的应用

3.1 在动物疾病模型的应用

虽然不同物种之间很少有相同的行为，但某些为解决日常生活中必要需求的行为在哺乳动物中都可以看到，这类活动被称为类共同行为(class-common behaviors)。类共同功能和行为的存在支持了涉及背外侧前额叶皮质的基本神经活动过程可以在啮齿类动物中进行有效研究的观点[5]，所以对动物模型的研究很有必要。应用双光子成像技术在应激、抑郁、阿尔兹海默症等动物疾病模型上监测PrL脑区神经元形态、数量、功能等的改变，目的是详细描述病理生理机制。在动物疾病模型上开展药理学研究，有助于研究药物治疗机制，对药物有效性和安全性进一步评价。

3.1.1 在应激啮齿类动物模型中的应用

应激(压力)会导致焦虑出现或加重，甚至造成认知障碍。同时，应激(压力)也是许多精神疾病的主要风险因素，如精神分裂症、广泛性焦虑障碍、重度抑郁障碍、双相情感障碍和创伤后应激障碍[15]。啮齿类动物研究表明，应激(压力)会诱导PFC、海马和杏仁核神经元的树突形态和树突棘发生显著变化。LIU等[16]对小鼠进行应激处理后用双光子激光扫描系统对Cg1和PrL区的第5层神经元进行成像，发现顶端树突的长度和远端树突的密度降低，进而导致顶端靶向兴奋性输入的反应减弱。LIU等[15]对小鼠进行7 d约束应激实验后进行双光子成像，发现慢性约束应激导致前扣带皮层(anterior cingulate,ACC)与PrL的树突回缩及树突密度降低。

3.1.2 在抑郁症啮齿类动物模型中的应用

有研究[17]表明，抑郁症患者PFC的突触密度降低。同样，啮齿动物慢性应激模型的额叶皮层中也出现突触缺陷，包括树突分支的减少、树突密度的降低和神经传递的衰减[18]。

30%的普通人群携带BDNF基因多态性，导致pro BDNF蛋白第66密码子(Val66Met)中缬氨酸到蛋氨酸的替代，携带Met多态性的人患与压力相关的严重抑郁症的风险增加。LIU等[19]将具有人类常见的BDNF Val66Met多态性基因敲入小鼠，使用双光子激光扫描系统对前扣带回第5层和PrL区内标记的神经元进行成像，发现小鼠的远端的树突顶端发生了结构性萎缩，PFC第5层锥体细胞的顶端靶向性兴奋性突触后电流(EPSCs)减少，树突密度和直径减少，突触形成和成熟受损。

多项研究[20-21]表明，东莨菪碱在抑郁症患者中可产生快速抗抑郁作用。VOLETI等[22]对东莨菪碱治疗1 d后的抑郁症大鼠进行麻醉取脑，从含有mPFC的组织块上切下400 μm厚的冠状切片，采用双光子激光扫描系统对前扣带回第5层和PrL区内标记的神经元进行成像，发现东莨菪碱显著增加了PFC第5层神经元远端节段棘突密度，近端树突密度无明显增加。此外，东莨菪碱可使上述神经元的远端和近端节段的树突棘直径增加，但增加程度并不显著。

3.1.3 在精神分裂症啮齿类动物模型中的应用

精神分裂症是一种常见的异质精神疾病，它的特征是出现阳性症状(妄想、幻觉和混乱的行为)，阴性症状(缺乏动机、情感迟钝、表达贫乏和社交退缩)，以及持久的神经认知障碍(注意力、处理速度、工作和长期记忆、执行功能和社会认知)。精神分裂症患者树突棘的过度修剪和异常的突触可塑性会导致大脑连接错误和突触效率低下，从而导致精神分裂症的主要负面症状和认知缺陷[23]。

ZHOU等[24]利用在体双光子成像技术对清醒小鼠PrL神经元钙浓度的变化进行记录，基于钙峰值的总数和钙瞬变频率来看，精神分裂症合并抑郁症的小鼠模型与经典抑郁模型、经典精神分裂症模型以及未处理的对照组小鼠相比，神经元活动均显著减少，钙信号较低。这表明伴有抑郁症的精神分裂症可能涉及一种独特的病理生理学，与单独的精神分裂症或抑郁症不同。

人类CHRNA5基因中编码a5 nAChR亚基的单核苷酸多态性(SNPs)增加了吸烟和精神分裂症的风险[25]。KOUKOULI等[26]对表达人类α5 SNP的清醒小鼠的PrL进行在体双光子钙成像来评估静息态网络活动，发现小鼠神经元活动减少，表现出类似精神疾病患者(包括精神分裂症和成瘾患者)前额叶活动过低的现象。

3.1.4 在阿尔兹海默病啮齿类动物模型中的应用

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)以大脑皮层和海马体淀粉样斑块和神经纤维缠结(NFTs)的扩散为特征。同时，可溶性β淀粉样蛋白(Aβ)寡聚物也被证实在AD患者的大脑中积累，其与认知功能障碍的相关性大于斑块沉积的程度。KOUKOULI等[27]通过以PrL为靶点向成年小鼠体内立体定向注射人突变淀粉样前体蛋白(AAV-hAPP)来诱导AD样缺陷。小鼠在体双光子成像显示，在可溶性寡聚物积累过程中，小鼠神经元活动增加，Aβ干扰了PFC神经元的同步自发活动，PFC以超低波动模式为病理特征。

3.2 用于正常动物高级认知活动的研究

啮齿动物PrL与灵长类的dlPFC功能相似，在认知过程起到重要作用。在特定行为过程中对动物PrL区进行双光子成像可以探索对任务的编码及表现。

3.2.1 奖励寻求机制的研究

啮齿类动物的mPFC皮层和皮层下结构广泛连接形成神经回路[28]，神经回路起到目标导向、帮助获得习惯性行为的作用[29]。巴甫洛夫条件反射是刺激与结果形成关联的过程[30]，通过监测整个巴甫洛夫奖赏条件反射过程中神经元的活动有助于研究者们探索复杂的神经回路如何编码奖赏相关信息来指导行为输出，KONDO等[31]发现PrL的神经活动比mPFC的浅表部(M2)更活跃。奖励前阶段的PrL活动可能反映了对奖励发放的期望，包括激励、对奖励的预测或对奖励时间的关注。OTIS等[32]发现前额叶皮层输出回路通过不同的线索编码来引导奖励寻求，具有投射特异性和解剖分离特性的前额叶神经元可以具有相反的活动动力学、可塑性和对条件奖赏寻求的功能控制。GRANT等[33]发现dmPFC中的异质性兴奋性神经元集合在线索-奖励学习中形成了专门的编码模式，并在学习后稳定保持，兴奋性输出神经元的活动动态可用于线索检测、线索辨别、奖励检测以及学习后舔舐的预测。但KONDO等[34]将小鼠头部固定，用两种声音线索训练小鼠(这两种声音所获得供水的概率不同)。在这一经典的条件反射训练后，实验者对小鼠3个背侧额叶区域(背内侧额叶皮层、背外侧额叶皮层、初级运动皮层)和PrL背侧部分进行双光子成像后显示：在小鼠接收声音线索来预测奖赏结果(奖赏或不奖赏)的过程中，dmPFC深层神经元活动最为强烈。

3.2.2 在注意转移活动中的应用

为了监测PFC神经元中与注意力转移相关的活动，SPELLMAN等[35]通过对PrL和IL进行双光子钙成像，发现PFC输出神经元不是实时调节注意力，而是整合和维护最近的行为及其后果的表征。mPFC活动并不会使注意转移过程中的感觉运动反应产生偏差，而是通过编码试验反馈信息来实现注意转移。

3.3 用于GABA-A受体激活对锥体神经元影响的研究

皮层中间神经元激活GABA-A受体，以快速调控锥体神经元的电信号和生化信号。为研究中间神经元抑制棘突和树突Ca2+信号的能力，MARLIN等[36]使用双光子显微镜对小鼠PrL的急性冠状切片中的胞体和树突进行成像，发现GABA-A受体的激活可显著抑制第5层锥体神经元棘突和树突的动作电位Ca2+信号。

3.4 对丘脑投射通路的研究

丘脑和前额叶皮层(PFC)之间的相互作用在认知功能和觉醒中起着关键作用，ANASTASIADES等[37]结合解剖示踪术、电生理学、光遗传学、双光子钙成像和药理学发现背内侧丘脑和腹内侧丘脑2个高阶丘脑投射到前额叶PrL区第一层(Layer1,L1)的不同网络。丘脑核具有独特的抑制微回路，可以影响树突和胞体的活动，对PFC的功能具有重要意义。

4 总结与展望

双光子钙成像技术的应用是钙成像领域的一大进展，极大地便利了在亚细胞结构或水平上的研究。双光子钙成像技术在啮齿动物PrL的应用，可帮助研究者们了解在特定行为下该区神经元的编码机制以及特定类型神经元突触功能和突触可塑性。通过构建动物疾病模型，对疾病的发生发展以及转归机制进行研究，可为疾病预防与治疗提供新的方向。目前，对于啮齿类动物前边缘皮层的研究主要在小鼠模型中进行，对于大鼠等其他啮齿动物前边缘皮层的神经机制研究相对较少。今后可以拓展实验动物类型，用双光子钙成像技术观察特定神经元钙活动，进一步在单细胞甚至突触水平了解各种疾病发病机制及其特征，也可比较啮齿动物间皮层机制的异同，间接帮助研究者们更深层次地探索人类背外侧前额叶皮层的功能与神经机制。

未来双光子钙成像技术的固定装置、成像视窗的构建方法以及成像窗口方法会不断进步，在活体成像时提高图像稳定度、清晰度，提高观察深度和精度[9]，为监测神经细胞钙离子变化提供更高质量设备基础。目前，双光子钙成像技术在PrL脑区的应用相对较少，但随着该技术的不断进步以及脑科学的不断发展，更多dlPFC背外侧前额叶的高级神经机制也将在啮齿动物体内进行探索。