CAR-T 细胞疗法中细胞因子释放综合征的研究进展

于肖肖，沈永明

（天津市儿童医院检验科，天津 300134）

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T 细胞疗法作为一种治疗癌症的新型疗法受到了广泛关注，该疗法的原理是利用患者自身的T 淋巴细胞在体外修饰后回输到患者体内来达到清除肿瘤细胞的目的。CAR-T 细胞表面的“定位导航”CAR 结合肿瘤相关抗原后，细胞被激活并释放一系列的毒性分子（穿孔素、颗粒酶、TNF-ɑ 等）诱导肿瘤细胞死亡。从第一代CAR-T 细胞到第四代CAR-T 细胞，逐步提高了CAR-T 细胞在体内更持久的作用活性。与传统抗肿瘤疗法相比，CAR-T 免疫疗法具有特异性高、起效快、缓解率高、疗效持久等特点。尽管CAR-T 细胞疗法在血液系统肿瘤的治疗过程中表现出了巨大的潜力，但是在实际应用过程中仍有很多难题需要解决。疾病治疗除了关注疗效外，亦要关注治疗过程中的毒副作用，CAR-T 细胞疗法在治疗过程中最常见的且最严重的副作用是细胞因子释放综合征。在即将到来的联合免疫治疗时代，为扩大免疫治疗的应用范围，对CRS 的正确认知及处理变得至关重要。CAR-T 细胞疗法与常规的生物疗法不同，它是一种活的T 细胞治疗药物，如何降低治疗过程中产生的毒副作用是目前亟待解决的难题。本文主要对CAR 的结构、CRS 的概念及分级、CRS 发生机制及药物管理、CAR 结构的优化作一综述，通过这些策略，未来的CAR-T 细胞疗法将有效降低CRS 产生，使患者得到更好的治疗效果，有望为临床提供有效的预防和管理策略，以提高这种疗法的安全性并扩大其应用范围。

1 CAR 的结构

CAR 主要由胞外抗原识别段、跨膜段、胞内信号传导域三部分组成[1]。胞外抗原识别段通常是来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv 段，可以特异性识别肿瘤相关抗原。跨膜段对于整个受体的稳定性是必需的。胞内信号传导域通常是CD3ζ，可以将激活信号传递给T 细胞。CD3ζ 可能无法提供完全有效的激活信号，因此需要共刺激信号。例如，CD28和4-1BB 可以与CD3ζ 一起使用以传递增殖/活化信号，或者将三者一起串联使用。此外，CAR 可以将细胞外抗原识别结构域与细胞内信号分子之间建立联系，而细胞内信号分子又可以激活T 细胞，从而发挥免疫治疗作用。

2 CRS 的概念及分级

CRS 是一种因免疫细胞被激活并释放大量细胞因子而引发的严重的全身炎症反应综合征，临床表现以发热和多器官功能障碍为特征。CRS 一般出现在CAR-T 细胞与肿瘤细胞抗原结合作用的过程中，大量细胞因子（例如IFN-y、TNF-α、IL-6 等）被释放，这些细胞因子又会引发进一步的连锁反应，激活宿主免疫细胞，最终导致CAR-T 细胞和内源性免疫细胞共同释放大量细胞因子，引起过度炎症反应、毛细血管渗漏、凝血级联反应等一系列不良反应，进而导致器官受损和脑肿胀，最终危及生命[2]。美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）在2019 年发表了关于CRS 分级共识指南指出，发热≥38℃是CRS分级的必要条件，根据低血压和缺氧的严重程度，CRS 被分为1～4 级，大于3 级即认为是严重的CRS，1 级定义为伴有或不伴有全身症状的发热（≥38℃）；2 级定义为发热（≥38℃），伴有低血压但不需要血管升压药，同时伴有缺氧，需要使用低流量鼻导管（≤6 L/min）或面罩给氧；3 级定义为发热（≥38℃），伴有低血压，需要一种升压药加用或不加抗利尿激素，同时伴有缺氧，需要高流量鼻导管或面罩给氧；4 级定义为发热（≥38℃），伴有低血压，需要多种升压药（抗利尿激素除外），同时伴有缺氧，需要正压呼吸（CPAP、BiPAP、气管插管、呼吸机）。这个分级系统已在临床研究中证实可对临床CRS 的严重程度进行准确，客观和可具有重复性的评估[3]。Alvi RM 等[4]对接受商业CAR-T（Yescarta 或Kymriah）以及其他非商业CAR-T 细胞治疗的患者进行研究，有59%的患者在回输2～7 d 后发生CRS，其中39%为2 级，4%为3 级及以上。而在其他临床研究中CAR-T 治疗引起的CRS 也并不少见。

3 CRS 的发生机制及药物管理

CAR-T 细胞疗法在肿瘤治疗中的应用日益增加，CRS 的预防与缓解仍是CAR-T 细胞治疗中科研工作者关注的焦点之一，或许在CRS 发生机制的多个环节进行干预可有效缓解CRS，提高其对更广泛癌症的安全性和有效性。大量研究表明[5-7]，内源性单核细胞和巨噬细胞在CAR-T 细胞治疗过程中是引起CRS 的主要细胞，靶向巨噬细胞将是提高安全性的潜在策略之一。而GM-CSF 作为组织急性及慢性炎症中起最关键作用的细胞因子，是激活巨噬细胞的关键因子之一。lenzilumab（一种抗人GMCSF 单克隆抗体）能够中和GM-CSF 的活性，抑制由GM-CSF 启动的炎症级联反应。ZUMA-19 的一项临床研究（NCT04314843）表明[8]，在CD19 CAR-T（Yescarta）细胞治疗弥漫大B 细胞淋巴瘤中联合应用lenzilumab，在推荐剂量下，患者并未出现严重的细胞因子风暴。GM-CSF 中和抗体以及靶向巨噬细胞药物联合使用或许能够使CRS 得到有效的控制。

CAR-T 细胞杀伤肿瘤时，肿瘤细胞焦亡发生涨破使细胞内ATP 大量释放至细胞外激活巨噬细胞[9，10]，使巨噬细胞释放大量的细胞因子导致CRS 发生。有研究表明[11]，很多肿瘤细胞中GSDME（gasdermins E）过量表达。CD19 CAR-T 细胞与CD19+原发性白血病细胞一起孵育时，CD19 CAR-T细胞释放的颗粒酶B 激活胱天蛋白酶3 后可激活GSDME，最终引发表达CD19 的肿瘤细胞发生焦亡。另有研究表明[12，13]，GSDME 水平越高，CRS 越严重，同时也提出了可通过药物干预焦亡发生，降低CRS发生概率。

妥珠单抗是全球首个获批上市的靶向IL-6R的人源化单抗，也是FDA 批准的用于CAR-T 细胞治疗过程中CRS 的治疗性药物，通过抑制下游炎症级联中起关键作用的IL6-信号降低CRS[14]。皮质类固醇已被证明可通过发挥强大的非特异性抗炎作用有效解决CAR-T 细胞输注后的CRS 症状[15]。而对于CRS，皮质类固醇通常用于危及生命的（3 级或4级）或托珠单抗耐药的CRS[16，17]。然而，皮质类固醇可能会通过抑制T 细胞功能、扩张和持久性，甚至诱导T 细胞凋亡而损害抗肿瘤功效[18]。另证据表明[19]，合理的皮质类固醇剂量方案可以保持CAR-T 细胞治疗的完整疗效，短期使用皮质类固醇可能是可行的。在临床实践中，需要进一步探索优化皮质类固醇方案，包括其剂量、时机和持续时间。达沙替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶的磷酸化，破坏激活域CD3zeta 的信号传导[20]，在临床前模型研究中，达沙替尼能迅速缓解CRS[21]，未来其可能在不影响CAR-T 细胞结构域的同时来降低CRS 发生风险。

4 CAR 结构的优化

CAR 结构的设计与CRS 的发生也有一定的关系，进一步在源头降低CRS 的发生成为未来CAR结构设计的焦点。利用蛋白质结构预测软件预测CAR 融合蛋白结构以及寻找更优的CAR 共刺激域也将是未来研究的重点之一。

临床研究表明[22]，41BB 共刺激结构域较CD28共刺激结构域引发的CRS 的概率低。以41BB 为共刺激结构域的CD19 CAR-T 细胞在针对B 系血液肿瘤的两项临床研究中 CRS 发生概率NCT02435849（77%）以及NCT02030834（57%）均低于以 CD28 共刺激结构域的 CAR -T 细胞NCT02348216（93%）和NCT02601313（91%）。Ying Z等[23]通过改造CD8a 肽段，发现CD19-BBz（86）CAR-T 细胞的抗肿瘤效果没有减弱，但细胞因子释放明显降低，且在相关临床试验中，25 例患者均未发生严重的CRS。

TALEN 和CRISPR-Cas9 等基因编辑技术已被用于设计具有GM-CSF 基因敲除的CAR-T 细胞[24-26]，从而减少促炎细胞因子（IL-6）和趋化因子（趋化因子配体2）的产生，通过减少对巨噬细胞的激活降低CRS 的发生。将自杀基因iCasp9 整合到CAR 结构内形成一个自杀开关，在发生CRS 时，利用小分子二聚体药物诱导细胞迅速凋亡[27]，这种不可逆的细胞凋亡导致CAR-T 细胞治疗终止，最终可能影响疗效。

CAR-T 细胞传导不依赖TCR 亚基，与肿瘤抗原接触有强直性信号。Helsen CW 等[28]研发了一种新的嵌合受体-T 细胞抗原偶联剂（TAC），该结构主要由3 部分组成：细胞外抗原结合域识别肿瘤抗原，细胞外anti-CD3 scfv 将TAC 分子与内源性TCR 衔接，CD4 共受体结构域将TAC 锚定在T 细胞表面并增加共受体功能。不同于CAR 结构，该结构本身没有信号传导功能，脱靶激活概率低，提示TAC 结构具有安全优势[29]。临床前实验表明[30]，TAC-T 细胞可以携带记忆T 细胞标记并有效侵入小鼠HER2+实体瘤中，但并没有发现明显的CRS，同时临床试验也表明靶向HER2（TAC01-HER2）的TAC-T 细胞可有效控制肿瘤生长且没有观察到CRS 以及与免疫细胞有关的神经毒性。另一款利用完整TCR 信号传导的新型嵌合受体-T 细胞受体融合构建体（TRuC），它将抗原识别结构域（scfv）整合到TCR 亚基上，不需要与HLA 匹配直接激活T 细胞识别杀伤肿瘤细胞[31-34]。与常规CAR-T 细胞相比，TRuC 成为TCR 复合体的功能组成部分，在血液瘤以及实体瘤的小鼠肿瘤模型中体现出了表现出强大的抗肿瘤效果以及低细胞因子释放，提示其未来临床中的安全性。在Gavocel，TC-210 治疗难治性间皮素临床试验中也初步验证了其安全性[35]。

5 总结与展望

目前CAR-T 细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了显著疗效，因此提高其安全性，降低患者痛苦将成为未来研究焦点；且设计下一代CAR-T 细胞释放较低的细胞因子，有效控制巨噬细胞等免疫细胞也将是解决CRS 最有潜力的方法。TAC-T 细胞以及TRuC-T 细胞技术平台可以有效地利用T 细胞固有的TCR 亚基向下传导信号，与普通CAR-T 细胞相比，具有在实体瘤治疗中发挥天然T 细胞对肿瘤细胞的调控机制的优点，在未来无论是在实体瘤治疗中应用还是防控细胞因子的分泌都具有较好的前景。随着研究者对CAR-T 细胞治疗过程中CRS 的发生发展机制更加清晰以及基因工程技术不断发展，未来更安全有效的CAR-T 细胞疗法将很快实现。