石草鞋化学成分及对人乳腺癌高转移细胞增殖的影响

唐素勤，罗 顺

（1.河南省中医药研究院，河南 郑州，450004；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州，450002）

石草鞋，又称铁足板、铁草鞋、打草鞋，为萝藦科植物球兰属香花球兰Hoya lyi Levl.［H.yuen-nanensis Hand.-Mazz］的全草［1］，广泛分布于海拔800～2400 m的丘陵、山地密林间，常附生于岩石和大树上。石草鞋性温，味辛、微酸，具有化瘀活血、祛风除湿、消积化食的功效，用于皮疹、跌打损伤、风湿关节痛、脚强痛、胸前饱胀［2］。石草鞋的主要化学成分为黄酮类、香豆素类、三萜类、有机酸类、甾体类等［3］，现代药理作用表明，石草鞋具有抗肿瘤、抗衰老、抗炎、降低血管 通 透 性、抗 病 毒 等 活 性［4］。代 红 梅 等［5］从 石 草 鞋95%乙醇提取物中分离得到11个化合物，除阿魏酸外，均为首次从石草鞋中分离得到。本研究组曾对石草鞋的化学成分进行分离，鉴定出39个单体化合物［6-8］。本研究组通过前期预实验，发现石草鞋对乳腺癌细胞具有一定的抑制作用。为进一步探讨石草鞋对乳腺癌细胞增殖影响的作用基础，笔者对石草鞋乙醇提取物再次进行分离纯化，并研究所得化合物对人乳腺癌高转移（MDA-MB-435）细胞增殖的影响，现报道如下。

1 仪器与材料

核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司，Avance Neo型），质谱仪（美国Thermofisher公司，TSQ Altis型），全自动转子离心机（惠州市华高仪器设备有限公司，Rosh87型），超声波清洗器（济宁隆成仪器设备有限公司，Kldk-1200L型），电子天平（广州晓芬仪器有限公司，Rohs1100型），葡聚糖凝胶LH-20（Sephadex LH-20，瑞士Pharmacia公司，20200911），柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂，100～200目、300～400目），薄层硅胶板（青岛海洋化工厂，GF254型），二甲基亚砜（德国Biofroxx公司，批号20200506），噻唑蓝（上海西唐生物科技有限公司，批号20210125），人乳腺癌高转移细胞株（MDA-MB-435，中科院上海生命科学研究院，批号20210219），5-氟尿嘧啶（海南卓泰制药有限公司，国药准字H20051626）。所用试剂均为分析纯。

石草鞋采自河南省郑州市，经河南省中医药研究院王治阳副主任药师鉴定为石草鞋Hoya lyi Levl.的全草，标本收藏于河南省中医药研究院标本室。

2 药材提取

取干燥的石草鞋全草21.4 kg，采用90%乙醇溶液加热回流提取3次，每次2 h。合并提取液，过滤、减压浓缩后，得石草鞋浸膏2.1 kg。浸膏经超声溶解于水中，分别采用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，所得提取液分别减压浓缩，得石油醚部分浸膏273.9 g、二氯甲烷部分浸膏217.4 g、丙酮部分浸膏172.9 g、正丁醇部分浸膏264.7 g。

3 提取物分离

3.1 二氯甲烷部分的分离

取二氯甲烷部分，采用硅胶拌样，经硅胶（100～200目）色谱柱，以石油醚-丙酮（75∶25-50∶50-25∶75）进行梯度洗脱，得到7个流分（Fr.B1～7）。Fr.B2（12.6 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以石油醚-乙酸乙酯（70∶30-50∶50-20∶80）进行梯度洗脱，得到6个组分Fr.B2-1～Fr.B2-6。Fr.B2-3（0.9 g）经硅胶（300～400目）色谱柱，以石油醚-丙酮（40：60）进行洗脱，得化合物2（19 mg）、5（26 mg）；Fr.B2-5（0.6 g）经结晶、重结晶，得化合物4（24 mg）。Fr.B4（17.4 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以石油醚-乙酸乙酯（50∶50-20∶80）进行梯度洗脱，得到7个组分Fr.B4-1～Fr.B4-7。Fr.B4-2（0.8 g）经硅胶（300～400目）色谱柱，以石油醚-丙酮（30：70）进行洗脱，得化合物1（28 mg）、8（31 mg）；Fr.B4-3（0.4 g）经Sephadex LH-20色谱柱，以甲醇进行洗脱，得化合物7（18 mg）。

3.2 乙酸乙酯部分的分离

取乙酸乙酯部分浸膏，采用硅胶拌样，经硅胶（100～200目）色谱柱，以二氯甲烷-丙酮（90∶10-50∶50-10∶90）进行梯度洗脱，得到7个流分（Fr.C1～7）。Fr.C3（10.3 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以二氯甲烷-丙酮（80∶20-50∶50-20∶80）进行梯度洗脱，得到8个组分Fr.C3-1～Fr.C3-8。Fr.C3-2（0.7 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以二氯甲烷-丙酮（40∶60）进行洗脱，得化合物10（25 mg）；Fr.C3-4（0.9 g）经硅胶（300～400目）色谱柱，以二氯甲烷-丙酮（30∶70）进行洗脱，得化合物3（32 mg）、12（17 mg）。Fr.C6（11.2 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以二氯甲烷-丙酮（30∶70-70∶30）进行梯度洗脱，得到5个组分Fr.C6-1～Fr.C6-5。Fr.C6-3（0.6 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以二氯甲烷-丙酮（40∶60）进行洗脱，得化合物6（23 mg）。

3.3 正丁醇部分的分离

取正丁醇部分浸膏，采用硅胶拌样，经硅胶（100～200目）色谱柱，以丙酮-甲醇（80∶20-50∶50-20∶80）进行梯度洗脱，得到8个流分（Fr.D1～8）。Fr.D4（8.1 g）经硅胶（100～200目）色谱柱，以丙酮-甲醇（80∶20-50∶50-20∶80）进行梯度洗脱，得到6个组分Fr.D4-1～Fr.D4-6。Fr.D4-3（0.4 g）经硅胶（300～400目）色谱柱，以丙酮-甲醇（30∶70）进行洗脱，得化合物9（31 mg）；Fr.D4-5（0.3 g）经Sephadex LH-20色谱柱，以甲醇进行洗脱，得化合物11（28 mg）。

4 化合物结构鉴定

化合物1：白色粉末（甲醇），分子式：C20H32O2，EIMS m/z：327.4［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：7.81（2H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-2，5），7.49（2H，q，J=8.2，2.2 Hz，H-3，4），3.97（4H，d，J=8.2 Hz，H-1'，1″），1.86（2H，m，H-2'，2″），1.04（12H，d，J=8.2 Hz，H-3'，3″，4'，4″）。13C-NMR（DMSO-d6，150MHz）δ：131.9（C-1），127.6（C-2），129.4（C-3），129.4（C-4），127.6（C-5），131.9（C-6），72.3（C-1'），28.1（C-2'），20.6（C-3'），20.6（C-4'），72.3（C-1″），28.1（C-2″），20.6（C-3″），20.6（C-4″），168.2（C=O）。以上数据与参考文献［9］isoagatholal数值基本一致。

化含物2：白色粉末（甲醇），EMS m/z：331.2［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：6.81（1H，s，H-5），5.24（1H，m，H-3），4.63（1H，d，J=8.2 Hz，H-4），4.23～4.08（1H，m，H-10），3.86（3H，s，6-OH3），3.75（3H，5，7-OCH3），2.59～2.51（1H，m，H-9β），1.95（1H，dd，J=12.0，8.2，2.2 Hz，H-9a），1.58（1H，m，H-11β），1.49（1H，m，H-11β），1.29（2H，m，H2-12），1.04（3H，t，J=8.2 Hz，H3-13）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：171.2（C-1），159.6（C-2），82.7（C-3），106.2（C-4），107.1（C-5），104.6（C-6），139.1（C-7），161.4（C-8），39.7（C-9），80.3（C-10），40.2（C-11），19.8（C-12），13.7（C-13），76.4（7-OCH3），56.9（C-OCH3）。以上数据与参考文献［10］monoeerin基本一致。

化合物3：黄色粉末（甲醇），ESI-MS m/z：200.7［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：7.57（1H，d，J=8.2 Hz，H-7），7.39（2H，d，J=8.2 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J=8.2 Hz，H-3，5），6.31（1H，d，J=8.2 Hz，H-8），3.84（3H，s，9-OCH3）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：129.1（C-1），127.4（C-2），117.5（C-3），163.1（C-4），115.4（C-5），1295（C-6），144.6（C-7），114.8（C-8），167.4（C-9），51.7（9-OCH3）。以上数据与参考文献［11］对羟基肉桂酸甲酯数值基本一致。

化合物4：白色粉末（甲醇），EMS m/z：413.1［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：7.13（1H，t，J=8.2 Hz，H-3），5.61（1H，d，J=8.2 Hz，H-1），5.39（1H，m，H-8），5.14（1H，m，H-10a），5.07（1H，m，H-10β），4.72（1H，d，J=8.2 Hz，H-1'），3.91（1H，m，H-6'a），3.75（1H，m，H-6'β），3.63（2H，m，H-6），3.37～2.94（4H，m，H-2'，3'，4'，5'），2.81（1H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-5），2.25（1H，q，J=8.2 Hz，H-9）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：96.5（C-1），91.4（C-2），152.8（C-3），108.4（C-4），27.3（C-5），35.1（C-6），170.8（C-7），133.6（C-8），45.1（C-9），120.7（C-10），175.8（C-11），102.4（C-1'），73.5（C-2'），77.4（C-3'），71.2（C-4'），78.1（C-5'），63.1（C-6'）。以上数据与参考文献［12］secologanoside基本一致。

化合物5：白色粉末（甲醇），EMS m/z：301.4［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：7.68（2H，dd，J=8.2Hz，2.2Hz，H-2，5），7.59（2H，dd，J=8.8Hz，2.2Hz，H-3，4），3.52（2H，d，J=8.2 Hz，H-1'，1″），1.96（2H，m，H-2'，2″），1.03（12H，m，J=8.2，H-3'，3″，4'，4″）。13CNMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：134.2（C-1），130.1（C-2），135.7（C-3），135.7（C-4），130.1（C-5），134.2（C-6），73.2（C-1'），28.3（C-2'），20.1（C-3'），20.1（C-4'），73.2（C-1″），28.3（C-2″），20.1（C-3″），20.1（C-4″），171.5（C-1α，2α）。以上数据与参考文献［13］邻苯二甲酸二正丁酯基本一致。

化合物6：黄色结晶（丙酮），ESI-MS m/z：214.7［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：9.71（1H，brs，4-OH），7.68（2H，d，J=8.2 Hz，H-2，6），6.81（1H，d，J=8.2 Hz，H-7），6.64（2H，d，J=8.2 Hz，H-3，5），5.71（1H，d，J=8.2Hz，H-8），4.05（1H，q，J=8.2Hz，H-1′），1.24（3H，t，J=8.2Hz，H-2′）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：125.1（C-1），134.0（C-2），112.1（C-3），132.6（C-4），111.2（C-5），136.1（C-6），143.0（C-7），115.4（C-8），166.2（C-9），60.1（C-1′），112.6（C-2′）。以上数据与参考文献［14］对羟基肉桂酸乙酯数值基本一致。

化合物7：白色粉末（丙酮），ESI-MS m/z：193.1［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：4.29（1H，m，H-7），4.20（1H，m，H-1α），3.71（1H，m，H-1β），2.83（1H，m，H-5），2.69（1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-4α），2.56（1H，m，H-9），2.51（1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-4β），2.05（1H，m，H-8），1.87（1H，ddd，J=14.0，12.0，8.2Hz，H-6α），1.68（1H，ddd，J=14.0，12.0，8.2 Hz，H-6β），1.03（3H，d，J=14.0 Hz，H-10）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：68.1（C-1），71.9（C-2），176.3（C-3），32.8（C-4），36.1（C-5），39.7（C-6），77.2（C-7），41.5（C-8），46.2（C-9），13.1（C-10）。以上数据与参考文献［15］isobonein数值基本一致。

化合物8：白色粉末（甲醇），ESI-MS m/z：309.7［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：7.71（1H，d，J=12.0 Hz，H-4），7.13（1H，d，J=12.0 Hz，H-5），6.68（1H，d，J=12.0 Hz，H-6），6.18（1H，d，J=12.0 Hz，H-3），5.06（1H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-2'），3.42（1H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-3'），3.28（1H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-3'），2.05（3H，s，H-4″），1.63（3H，s，1″-CH3），1.41（3H，s，1″-CH3）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：132.4（C-1），155.8（C-2），116.1（C-3），147.9（C-4），125.4（C-5），107.1（C-6），165.8（C-7），112.1（C-8），149.2（C-9），114.7（C-10），107.3（C-1'），89.7（C-2'），29.8（C-3'），83.6（C-1″），168.5（C-3″），25.1（C-4″），26.4（1″-CH3），21.3（4″-CH3）。以上数据与参考文献［16］columbianetin acetate数值基本一致。

化合物9：白色粉末（甲醇），ESI-MS m/z：427.1［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：5.73（1H，d，J=12.0 Hz，H-6），4.68（1H，d，J=12.0 Hz，H-1’），4.51（1H，d，J=12.0 Hz，H-7），1.27（3H，s，12-OCH3）。13CNMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：95.3（C-1），135.2（C-2），155.7（C-3），111.4（C-4），128.3（C-5），142.6（C-6），77.1（C-7），74.0（C-8），52.3（C-9），57.8（C-10），168.3（C-11），100.5（C-1'），72.4（C-2'），76.1（C-3'），70.2（C-4'），77.6（C-5'），59.3（C-6'），50.1（12-OCH3）。以上数据与参考文献［17］gentioside数值基本一致。

化合物10：白色晶体（甲醇），ESI-MS m/z：218.9［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：12.51（1H，s，-OH），6.08（1H，d，J=12.0 Hz，H-4），5.91（1H，d，J=12.0 Hz，H-7），4.03（3H，s，6-OCH3），3.84（3H，s，5-OCH3），2.61（3H，s，2-OCH3）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：200.4（C-1），106.1（C-2），171.2（C-3），93.9（C-4），166.2（C-5），161.7（C-6），90.8（C-7），33.1（2-OCH3），55.4（5，6-OCH3）。以上数据与参考文献［18］crototropone数值基本一致。

化合物11：白色粉末（丙酮），ESI-MS m/z：174.8［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：9.62（1H，s，H-7），7.38（2H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-2，6），6.93（1H，d，J=12.0 Hz，H-5），3.85（3H，s，4-OCH3）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：129.1（C-1），131.4（C-2），145.7（C-3），161.3（C-4），112.7（C-5），117.4（C-6），56.3（4-OCH3），192.5（7-CHO）。以上数据与参考文献［19］3-羟基对甲氧基苯甲醛数值基本一致。

化合物12：白色粉末（丙酮），分子式：C15H22O3，ESI-MS m/z：272.8［M+Na］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：6.41（1H，d，J=12.0 Hz，H-13a），5.64（1H，d，J=12.0 Hz，H-13β），4.27（1H，m，H-8），4.08（1H，t，J=12.0 Hz，H-4），0.93（3H，d，J=12.0 Hz，H-14），0.76（3H，s，H-15）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：45.1（C-1），25.3（C-2），30.5（C-3），85.1（C-4），46.3（C-5），38.1（C-6），49.2（C-7），83.5（C-8），46.3（C-9），31.4（C-10），139.7（C-11），171.2（C-12），118.4（C-13），20.6（C-14），19.3（C-15）。以上数据与参考文献［20］2-desoxy-4-epi-pulchellin数值基本一致。

5 抑制细胞增殖活性成分筛选

采用噻唑蓝（MTT）法［21］测试12个化合物的体外抗MDA-MB-435细胞的活性，以5-氟尿嘧啶为阳性对照物。取对数生长期的MDA-MB-435细胞，稀释成密度为每毫升5×104个的单细胞混悬液，每孔取100μL置于96孔板中，在37.0℃恒温条件下培养24 h。然后分别加入5-氟尿嘧啶，5种不同浓度的化合物（0.1、1.0、5.0、10.0、15.0μg/mL），培养24 h后，每孔分别加入10μL MTT溶液染色，继续培养6 h，移弃上清液。每孔分别加入100μL二甲基亚砜溶液，轻摇均匀。采用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度，计算MDA-MB-435细胞的抑制率及半数抑制浓度（IC50）值。结果显示化合物2的IC50值为12.35μg/mL，化合物10的IC50值为9.51μg/mL，其他化合物对MDA-MB-435细胞无明显抑制作用。见表1。

表1 石草鞋中12种化合物对人乳腺癌高转移细胞的体外抑制率及半数抑制浓度

6 结论

本研究从石草鞋90%乙醇提取物中分离得到12个化合物，所有化合物均为首次从石草鞋全草中分离得到，其中化合isoagatholal（1）、monoeerin（2）、isobonein（7）、gentioside（9）、crototropone（10）为首次从该属植物中分离得到。化合物monoeerin（2）、crototropone（10）对MDA-MB-435细胞具有一定的抑制作用。本研究丰富了石草鞋的化学成分资料库，为抑制细胞增殖新药的研发提供了一定依据。