猴头菇子实体寡糖的制备及抑制酪氨酸酶活性的研究

2023-01-18郭宇婷鲍金秋沙建军霍光明

南京晓庄学院学报 2022年6期

郭宇婷，鲍金秋，沙建军，霍光明*

(1. 南京晓庄学院食品科学学院/南京市食用菌产业技术研究中心，江苏南京 211171；2. 南京金时川生态农业科技有限公司，江苏南京 211121)

猴头菇(Hericiumerinaceus)是我国传统食药用菌，营养丰富且具有安神、抗癌的作用，对身体虚弱、消化不良、失眠、十二指肠溃疡、慢性胃炎、消化道肿瘤等疾病有很好的治疗作用[1， 2].目前，猴头菇的研究主要集中在多糖方向[3-5]，多糖具有较好的活性，但分子结构过大、水溶性较差、血脑屏障通过率较低，多糖活性成分的释放变得困难，不易被人体消化吸收.与多糖相比，寡糖具有类似多糖的活性，但分子量更小，易被人体吸收利用[6]，但猴头菇寡糖在有效成分的提取、生理功能研究和结构鉴定等方面鲜见报道.

本研究采用热水浸提法从猴头菇子实体中提取寡糖，用蒽酮硫酸法测得寡糖含量，乙醇沉淀制得粗寡糖通过离子交换层析法进行分离纯化.通过离子交换色谱法、高效液相色谱法、傅里叶变换红外光谱方法，测定寡糖样品中单糖组分、分子量、红外图谱等结构信息，并评价寡糖样品对酪氨酸酶的抑制活性能力.

1 材料和方法

1.1 材料

猴头菇子实体来源于南京晓庄学院菌物研究所食用菌生产基地，选取品相优良、外观完整、个头适中的猴头菇子实体，剔除根部及霉烂部分，沥去多余水分，去皮称重.将猴头菇切片处理，放置于烘箱50 ℃下烘干至恒重，制成干猴头菇片，在高速粉碎机中粉碎成 60目的猴头菇粉末，以便溶剂能充分浸提其中寡糖物质.

1.2 实验方法

1.2.1 猴头菇寡糖提取、分离和纯化

猴头菇粉(273 g)与石油醚(m：v=1∶5)浸泡除脂，除脂猴头菇粉末加入蒸馏水(m：v=1∶20)，80 ℃提取12 h，用30～50 μm定性滤纸过滤，滤液浓缩后与乙醇(最终浓度为 80%)混合沉淀，得到乙醇沉淀部分.沉淀部分重新溶解后用5KD超滤膜再生纤维素膜PLCC(美国 Millipore公司)分离，渗透液浓缩后经 DEAE Sephadex A-50柱分离纯化.

1.2.2 单糖组成测定

先取16种单糖标准品配成标准品溶液，采用离子色谱仪[7]测定单糖组成，分别精密称量10.00 mg(H8026和H8053)猴头菇样品置于安瓿瓶中，加入3M TFA 10 ml，120 ℃水解3 h.准确吸取酸水解溶液转移至管中氮气吹干，加入10 ml水涡旋混匀，吸取100 μL加入900 μL去离子水，12000 rpm下离心5 min.取上清液进行IC分析.

色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150);流动相：A:H2O； B:15 mM NaOH；C: 15 mM NaOH&100 mM NaOAC；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：30 ℃；检测器：电化学检测器.

1.2.3 分子量测定

精密称取样品和标准品右旋糖酐分子量标准配套(Dextran Standards Kit，Sigma)，样品配制成5 mg/ml溶液，12000 rpm 离心10 min，上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8 ml进样小瓶中.通过HPGPC[8]测定多糖分子量和纯度.

色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8 × 300 mm)；流动相：0.05 M NaCl溶液；流速：0.6 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测器：示差检测器RI-10A.

1.2.4 傅里叶红外图谱分析

精密称取样品2 mg和溴化钾 200 mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成.分别置于傅里叶变换红外光谱仪[9]FT-IR650(天津港东科技发展股份有限公司)进行扫描记录，而后分析多糖的官能团.

1.2.5 猴头菇寡糖抑制酪氨酸酶活性的测定

参照文献抑制酪氨酸酶活性测定方法[10， 11]，并稍做修改.实验分为四组，包含阴性对照组、空白组、空白对照组、实验组.底物为20 mmol/L的L-多巴，不同浓度(包含0.5 、1.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL)的猴头菇寡糖H8026和H8053组分，各浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的VC样品溶液，将底物与酶的浓度保持恒定，改变抑制剂浓度，测定酶催化活力，得到酶抑制率.反应液总体积为200 uL，混匀；在加底物前，先将96孔板放置在酶标仪30 ℃下预热5 min，反应10 min，在波长475 nm下测定，平行实验3次.酪氨酸酶活性的抑制率计算如下：

抑制率=[(A-B)-(D-C)]/(A-B)×100%

(1)

其中，A(阴性对照):磷酸缓冲液+酪氨酸酶+底物；B(空白组):磷酸缓冲液+底物；C(空白对照组)：磷酸缓冲液+不同浓度(多糖和VC)抑制剂样品+底物；D(实验组)：磷酸缓冲液+不同浓度(多糖和VC)抑制剂样品+酪氨酸酶+底物.

2 结果与分析

2.1 猴头菇寡糖的制备

猴头菇寡糖经除脂、水提醇沉和膜过滤后，经DEAE Sephadex A-50柱分离纯化得到组分H8026和H8053(图1)，质量分别为5.72 g和7.34 g.

图1 浓度为0.1 mol/L NaOH的80%乙醇沉寡糖洗脱峰图

2.2 单糖组成分析

采用离子色谱法分析寡糖中单糖组分(图2).标准母液溶液中16种单糖标准品(图2A)为(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)，其出峰时间依次为6.125、11.284、11.717、12.384、14.000、15.475、17.517、19.359、20.275、20.850、23.700、25.959、44.675、45.317、47.475、50.184.根据单糖标准品出峰时间鉴定H8026和H8053猴头菇寡糖的单糖组成.

对照图2A单糖混合对照标准品色谱图中的主要色谱峰的保留时间，则H8053中的单糖由阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖和木糖组成(图2B)，其摩尔比例为0.177∶0.010∶0.078∶0.479∶0.019∶0.237(表1)；而H8026由半乳糖、葡萄糖和木糖组成(图2C)，摩尔比例为0.966∶0.020∶0.014(表1).

图2 混标16糖、H8053单糖及H8026单糖的离子色谱图

表1 H8026和H8053单糖组成、保留时间、摩尔比以及相应面积

2.3 分子量测定

本实验采用HPLC凝胶色谱法测定猴头菇寡糖的分子量测定及纯度.HPLC凝胶色谱法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高的优点.lgMw-RT(重均分子量)校正曲线方程为：y=-0.1817x+11.798，R2=0.9958；根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出样品的分子量(表2).结果表明，H8026猴头菇寡糖在46.897 min出峰，lgMw分别为3.3，重均分子量Mw为1892，峰面积比为82.329%；H8053猴头菇寡糖出峰时间在46.964 min，lgMw分别为3.3，重均分子量Mw为1839，峰面积比为77.647%.

表2 H8026、H8053猴头菇寡糖的分子量及峰面积

2.4 猴头菇寡糖红外图谱分析

H8053及H8026寡糖组分的红外图谱分析结果见图3.H8053在3315cm-1吸收峰是糖类的特征峰，归因于O-H的伸缩振动.1735cm-1、1695cm-1属于C=O伸缩振动，1625cm-1属于N-H变角振动，1403cm-1属于C-O伸缩振动，1047cm-1、1031cm-1处属于O-H变角振动[12].H8053在850cm-1处有吸收峰，由此判断该寡糖是β-吡喃糖.H8026在3423cm-1、3311cm-1是糖类O-H的伸缩振动吸收峰，1735cm-1、1695cm-1属于C=O伸缩振动，1623cm-1属于N-H变角振动，1407cm-1属于C-O伸缩振动，1047cm-1、1031cm-1属于O-H变角振动[12].