Fe2+-H2O2-RhB体系荧光猝灭法测定CAT活度

2023-01-18张爱菊薛林科戴兴德张小林

分析科学学报 2022年6期

张爱菊，白莹，董娜，薛林科，戴兴德，张小林*

(甘肃医学院，甘肃平凉 744000)

过氧化氢酶(CAT)广泛存在于生物组织细胞中，可适时分解糖代谢中间产物H2O2，在抗衰老、防病变等方面发挥重要生理作用[1,2]。自1811年CAT首次被发现以来，关于其活性测定方法的研究从未停止，相继出现了滴定法[3]、光度法[4 - 8]。目前，研究的热点主要集中于催化光度法[9]。

荧光光度法集稳定性、高灵敏性、低成本等于一体，罗丹明B(Rhodamine B，RhB)结构特殊，荧光产率高[10,11]，当其醌式结构遭到破坏，分子失去平面刚性结构而发生荧光猝灭。罗丹明B作为荧光探针在微量分析领域得到广泛应用[12 - 14]，有文献报道碘-罗丹明B缔合物荧光探针用于测定鱼肝提取液中CAT活度[15]。本文实验发现，在Fe2+和H2O2的共同作用下，罗丹明B也存在荧光猝灭现象，CAT分解H2O2使罗丹明B荧光得以保留，根据CAT加入前后荧光强度差值ΔF可求得CAT活度。实验对反应条件和抗干扰能力做了详细考察，发现检测体系具有更理想的稳定性和环境适应性，血清微量获取并可直接用于酶活度检测，方法有望早日应用于临床检验。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

930N荧光光度计(上海精科)。

H2O2(30%，国药集团化学试剂有限公司)：将30%H2O2稀释500倍，化学分析法测其浓度，逐级稀释1×10-3mol/L。CAT(≥3 000 U/mg,阿拉丁)标准溶液，称取0.0050 g CAT，蒸馏水溶解，100 mL容量瓶定容，化学分析法测活度(E=100 U/mL)，二次稀释至1 u/mL。罗丹明B(RhB)溶液：分析天平称取0.0250 g RhB(分析纯，福晨化学试剂有限公司)，蒸馏水溶解，500 mL容量瓶定容，根据准确浓度二次稀释至1×10-4mol/L。0.1 mol/L pH 4.2的HAc-NaAc缓冲溶液。

1.2 测定方法

在50 mL的容量瓶中加入血清(25～100 μL)和H2O2(2.80 mL)，30 ℃水浴反应10 min，然后依次加入罗丹明B(5.00 mL)、HAc-NaAc(2.50 mL)和Fe2+(0.40 mL)，常温静置15 min后定容，蒸馏水作参比，在585 nm发射波长处测荧光强度F。同步测定酶空白体系F0(在血清中先加入罗丹明B、缓冲溶液和Fe2+，振荡30 s使酶失活，再加H2O2室温反应15 min)。CAT活度E(1 mL CAT溶液所消耗H2O2物质的量(μmol))由ΔF(ΔF=F-F0)确定。

2 结果讨论

2.1 光谱分析

在585 nm处，罗丹明B有特征荧光峰(图1a)；Fe2+作催化剂，H2O2氧化罗丹明B致其荧光猝灭，荧光强度F减小(图1b)；CAT分解H2O2使得体系中H2O2浓度降低，从而一定程度上保持了罗丹明B的荧光(图1c)，荧光保留程度与CAT活度有关系。本实验确定罗丹明B荧光发射波长为585 nm。

2.2 荧光猝灭条件考察

2.2.1 催化剂考察本文选择Fe2+和Fe3+作催化剂并对催化性能作比较。结果发现：罗丹明B和RhB+H2O2两体系荧光光谱保持一致(图2a)，说明在无催化剂情况下，H2O2不能氧化RhB；加入H2O2，同时加入Fe2+或Fe3+后，均出现荧光猝灭(图2b、图2c)，Fe2+作用下的罗丹明B猝灭程度更大(图2b)；不加H2O2时，Fe2+和Fe3+分别与罗丹明B混合，Fe2+对罗丹明B无影响，而Fe3+亦可实现罗丹明B荧光等效猝灭(图2d)。由此说明，Fe3+不是催化剂而是氧化剂；本实验选择Fe2+作荧光猝灭反应的催化剂。

图1 不同溶液的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of different solutions

图2 催化作用比较Fig.2 Comparison of catalysis

2.2.2 罗丹明B用量酶活性的测定范围与罗丹明B的用量有着密切的关系，若罗丹明B的用量偏小，酶活性的测定范围变窄；若用量偏大，分子之间的缔合作用导致体系的稳定性变差，测定准确度降低。pH 4.2 HAc-NaAc缓冲介质中，考察罗丹明B荧光强度随溶液体积的变化情况。结果显示，体系的荧光强度F值随着溶液体积的增大而逐渐增大，当罗丹明B在0.00～5.00 mL范围内时，荧光强度与体积有线性关系，因此罗丹明B的最佳用量确定为5.00 mL，此时罗丹明B反应液浓度为1.0×10-5mol/L。

2.2.3 溶液pH考察RhB荧光猝灭实为氧化反应，酸性环境更有利于H2O2得电子，也将最大限度减少Fe2+沉淀损失。对于荧光猝灭反应体系H2O2+RhB+Fe2+，其它条件不变，在pH 1.0～5.5范围内进行溶液pH考察，结果表明，荧光强度在pH 4.2出现一最低值，故选择HAc-NaAc缓冲溶液作猝灭反应介质，最佳用量确定为2.50 mL。

2.2.4 荧光猝灭反应时间考察其它条件不变，考察氧化反应时间对H2O2+RhB+Fe2+体系荧光强度的影响。结果表明，在催化剂Fe2+的作用下，罗丹明B快速被氧化，荧光强度在5 min内迅速下降，5 min后反应变缓，15 min后降到最低且保持恒定。因此猝灭反应时间确定为15 min。

2.2.5 Fe2+用量的选择其它条件不变，在0.00～0.20 mL范围内，测定加入不同体积Fe2+时的H2O2+RhB+Fe2+体系荧光强度。结果可知，当V(Fe2+)=0.00 mL时，罗丹明B与H2O2几乎不反应；荧光强度F随Fe2+体积增大而减小；当V(Fe2+)>0.60 mL时，荧光猝灭反应程度受限，应该是过量Fe2+促使H2O2分解。因此，Fe2+用量设定为0.40 mL。

2.3 酶促反应条件优化

2.3.1 底物H2O2体积优化针对酶空白体系，在最佳猝灭反应条件下，改变H2O2体积用量，测定荧光强度。结果显示荧光强度随H2O2体积增加而减小，在0.00～2.80 mL范围内有明显的猝灭现象，且荧光强度和H2O2体积有良好的线性关系，当H2O2体积大于2.80 mL时，线性关系变差。为了增大酶活性测定范围，减小系统误差，取1×10-3mol/L H2O2溶液2.80 mL作酶反应底物。

2.3.2 酶促反应时间影响取CAT标准溶液1.00 mL，仅改变酶促反应时间，测定ΔF。结果表明，酶促反应速度较快，前5min，ΔF与时间有线性关系，这符合一级反应特征；10 min后，ΔF保持一个最大值恒定不变。故将酶促反应时间定为10 min。

2.4 方法对CAT的分析性能

针对CAT+H2O2+RhB+Fe2+体系，在0.00～3.50 mL体积范围内改变CAT标准溶液用量，在最佳条件下测定F、F0并计算ΔF，绘制工作曲线。结果显示：CAT的加入促使罗丹明B荧光恢复(图3)，荧光强度增幅ΔF与CAT活度E在5.6×10-5～5.6×10-2U/mL范围内具有良好的线性关系(图3内插图)：ΔF=-3.466+1 472E(U/mL)，r=0.9962，平行测定酶空白10次，标准偏差的3倍除以斜率求得检测限为2.6×10-5U/mL。