杨梅果实维生素C与游离氨基酸含量的相关性分析

张启，梁森苗，王嵘，林瑞，胡佳卉，郑锡良，戚行江，张淑文*

(1.兰溪市经济特产技术推广中心，浙江 金华 321102；2.浙江省农业科学院，浙江 杭州 310021)

杨梅是杨梅科杨梅属小乔木，是我国南方著名的特色经济树种，主产浙江、江苏、福建、江西、广东、广西等地，具有较高的营养与经济价值。氨基酸是蛋白质的组分，是许多重要合成途径的前体物质，是影响食品风味的重要因素，具有甜、苦、酸、涩、鲜等味感，从而形成了风味迥异的食物[1-2]。氨基酸种类、含量及其组成成分的比例是影响食品营养的关键因子，也是评价食品质量的重要指标之一[3]。目前氨基酸含量的测定主要有茚三酮比色法[4]、液相色谱法[5-6]、氨基酸仪分析法[7]等，比色法操作简便，但是只能检测个别种类氨基酸，生成产物容易不稳定；高效液相色谱法虽然高效通用，但灵敏度低；氨基酸分析仪采用柱后衍生化系统具有选择性高、针对性强，分析速度快、准确度高等特点。戴宏芬等[8]利用柱前衍生反相高效液相色谱法在4个杨梅品种果实检测到可统计的14种氨基酸。张泽煌等[9-10]利用氨基酸自动分析仪对不同杨梅品种果实的氨基酸含量进行测定，发现杨梅果实氨基酸种类丰富，共检测到17种游离氨基酸，且不同种间氨基酸含量差异较大。

维生素C(VC)是人体必不可少的营养元素，人体只能从果蔬中摄取。VC由于其高效的抗氧化性，在人类机体的健康发育及预防众多疾病中发挥着不可或缺的作用[11]。迄今，植物体内较公认的4条VC合成途径包括：L-半乳糖途径(D-甘露糖途径)、D-半乳糖醛酸途径、古洛糖酸途径和肌醇途径[12]，但杨梅中VC合成途径尚不明确。本实验以13份杨梅种质为试验材料，测定其VC等果实品质指标和游离氨基酸含量，对品质和氨基酸相关性进行分析，明确果实游离氨基酸与品质指标间的相关系数，为杨梅果实VC合成途径研究提供新参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验采集到13份杨梅种质，文中依次用编号YM1、YM2、YM3、YM4、YM5、YM6、YM7、YM8、YM9、YM10、YM11、YM12、YM13对应表示，其中，YM12为东魁，YM13为荸荠种，其余均为兰溪市地方种质，暂未命名。在果实成熟期随机采摘无病虫害、生长均匀的果实若干，放入保鲜盒运回实验室，经液氮冷冻后，-80 ℃保存，用于氨基酸和果实品质测定。13份杨梅果实采摘地、颜色、树体特性如表1所示。

表1 杨梅种质信息

1.2 试剂与仪器

主要试剂：盐酸、苯酚、不同pH和离子强度的洗脱缓冲液，蒸馏水，乙腈，茚三酮溶液。17种氨基酸溶液混合标准物质，分别为天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)。

主要仪器：日立LA-8080全自动氨基酸分析仪、氮气浓缩仪、电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、紫外分光光度计、游标卡尺。

1.3 试验方法

1.3.1 氨基酸测定样品前处理

样品前处理参照国家《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》(GB 5009.124—2016)。将保存于-80 ℃冰箱的杨梅果实，用液氮研磨成粉末，准确称取0.1 g试样置于水解管中，加入10 mL 6 mol·L-1的盐酸溶液，3～4滴苯酚，将水解管放入冷冻剂中3～5 min或液氮冷冻至一半结冰，抽真空(接近0 Pa)，充氮气，重复抽真空-充氮气3次后，在充氮气状态封口。将已封口的水解管放置在(110±1)℃的电热鼓风恒温箱中，水解22～24 h，取出冷却至室温。

打开水解管，将水解液过滤至50 mL容量瓶中，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一个100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。准确吸取5 mL滤液移入10 mL试管内，用浓缩仪在40～50 ℃加热环境下减压干燥，干燥后残留物用水溶解，再减压干燥，最后蒸干。将0.02 mol·L-1盐酸缓冲溶液加入到干燥后的试管内振荡溶解，涡旋混匀后，吸取溶液过膜，供仪器测定用。混合氨基酸标准溶液和样品测定液分别注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。

1.3.2 氨基酸测定方法

磺酸型阳离子树脂分离柱(4.6 mm×60.0 mm)，柱温57.0 ℃，反应器温度135 ℃，泵A(洗脱溶液)流速为0.40 mL·min-1，泵B(茚三酮溶液)流速为0.35 mL·min-1，进样量为20 μL，重复3次；检测波长为570 nm和440 nm。

1.3.3 果实品质测定方法

每份种质资源选取15个果实，用电子天平称量单果质量，采用游标卡尺测量果实纵径和横径(测量部位为果实中心处十字交叉)，计算果形指数=纵径/横径，总糖、柠檬酸、VC含量使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒，采用分光光度法测定。

1.4 数据处理和统计分析

所得数据利用统计软件SPSS 22.0 进行数据和相关性分析，使用Duncan’s 法进行差异显著分析(P<0.05)，采用Excel 2013进行表格制作。

2 结果与分析

2.1 不同种质杨梅果实品质分析

由表2可以看出13种不同种质杨梅单果重相差较大，单果重在4.38～16.69 g，其中YM12最大，YM9最小，YM12与其他各组组间差异显著。果实纵径大小在20.65～28.78 mm，横径范围为20.86～29.2 mm，YM12最大，YM9最小。果形指数是评价果实品质指标之一，果形指数在0.94～1.13。总糖含量最高的为YM2，高达121.26 mg·g-1，最低为YM6，含量为61.67 mg·g-1。果实中酸成分及含量对果实品质有很大的影响，不同杨梅种质果实柠檬酸含量在9.28～14.47 g·kg-1，其中YM12含量最高，YM13最低。不同种质间VC含量差异明显，在409.5～986.7 mg·kg-1，含量丰富。

2.2 杨梅果实中游离氨基酸含量分析

本次试验对杨梅果实进行了游离氨基酸定性和定量分析，共检测出17种游离氨基酸，可统计的有16种(色氨酸在酸水解过程中容易被降解，故未检测出，半胱氨酸由于是含硫氨基酸，酸解条件下检测数据不稳定，未统计)。如表3所示，果实总游离氨基酸(total free amino acid,TFAA)变化范围为4.13～7.55 mg·mL-1，平均为 5.26 mg·mL-1，YM12含量最高为7.55 mg·mL-1，显著高于其他杨梅品种，其次是YM13，总游离氨基酸含量最低的是YM10为4.13 mg·mL-1。杨梅中包括8种人体必需氨基酸(essential amino acid,EAA)，分别为赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸，其中组氨酸为婴幼儿所必需。必需氨基酸含量在1.70～2.71 mg·mL-1，占总游离氨基酸的35.75%～45.14%。必需氨基酸中含量最高的为赖氨酸，最大占比为22.48%，赖氨酸平均占必需氨基酸总量的21.70%，其次为亮氨酸，平均值为19.35%。其他8种为人体非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)，这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等，介于2.37～4.73 mg·mL-1，占总游离氨基酸的 55.08%～64.25%。非必需氨基酸中含量最高的为天冬氨酸，最大占比为37.09%。天冬氨酸与非必需氨基酸百分比的平均值为24.74%，其次是谷氨酸为21.73%。

表2 不同种质杨梅果实常规品质分析

表3 不同品种杨梅果实游离氨基酸组分含量 单位：mg·mL-1

杨梅果实中还包括一些特殊氨基酸，如药用氨基酸(medicinal amino acid,MAA)、呈味氨基酸(taste-active amino acid,TAA)等。MAA是植物中含量少，人体不能完全合成，但又是维持机体氮平衡所必需的，包括天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸等9 种[13]。杨梅果实中药用氨基酸含量范围在2.59～4.63 mg·mL-1，均值为3.35 mg·mL-1，YM12含量最大为4.63 mg·mL-1，其次是YM6为4.24 mg·mL-1。TAA包括天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸等6种，能使食物呈现出特殊的风味。杨梅TAA含量1.92～3.67 mg·mL-1，YM12含量最高为3.67 mg·mL-1，其次是YM6为3.36 mg·mL-1。TAA含量占总游离氨基酸的43.63%～54.11%，平均占比为48.43%，YM6占比最大，YM1最小(表4)。

表4 不同品种杨梅果实游离氨基酸组分比例 单位：%

2.3 果实氨基酸与VC含量相关性分析

对不同氨基酸与VC含量进行Pearson相关性分析，相关系数如表5所示，杨梅果实游离氨基酸与VC含量间均为负相关关系；除酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸之外，其余氨基酸及总游离氨基酸含量与VC含量之间呈现显著负相关，其中，脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸与VC含量之间呈极显著性负相关。

表5 果实氨基酸与VC含量间的相关性分析

3 讨论

氨基酸是果实品质营养价值重要因素之一，也成为评价品质的一个重要方面。果实品质受树体生长和发育过程营养状况和环境条件等因素的影响，可通过选育优良品种、提高植株营养状况和改善生长环境等手段提升营养品质。本研究测定了13份杨梅种质果实VC等品质指标和氨基酸含量，结果表明：必需氨基酸中赖氨酸和亮氨酸含量占比最大，非必需氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸占比最大，与朱奕凡等[10]研究结果相似。同时，YM6的呈味氨基酸和药用氨基酸占总游离氨基酸的比重最大，其风味更浓郁，可作为风味种质资源进行利用。杨梅种质间VC含量差异较大，其中，YM10含量最高，可作为高VC含量种质进行利用。本研究中利用的种质资源具有不同的品质特性，可根据不同目标开展种质创新、杂交选育、功能基因挖掘等工作。杨梅果实中MAA占总游离氨基酸的百分比为61.16%～68.44%，平均值为63.63%，高于红枣[14-15]，石斛[16]，低于枇杷[17]、枸杞[18]，可为杨梅保健食品开发提供一定的物质基础。

对品质性状进行相关性分析的方法在农业科研领域应用广泛，徐阳等[19]研究了红美人柑橘果实大小与风味品质的相关性；郑浩等[20]明确了不同成熟度橄榄果实表观性状与内在品质的变化和相关性；刘聪等[21]以蜜瓜为试材，研究不同贮藏温度对其采后果实质构特性、理化指标、感官品质变化及相关性分析。大量研究分析了品质性状间的关联度，而关于品质性状，尤其是VC含量与氨基酸之间相关性分析研究较少，本研究探析了杨梅种质资源果实VC与游离氨基酸含量间的相关性，结果显示：脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸与VC含量之间呈极显著性负相关。精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、总游离氨基酸与VC含量之间呈显著性负相关，推测杨梅果实VC与上述游离氨基酸合成途径的调控机制间可能存在竞争关系，因此，我们可开展杨梅果实VC与极显著负相关的游离氨基酸合成通路研究，明确不同通路间的共同因子和调控关系，再通过外源施加或其他有效措施，提高杨梅果实VC与游离氨基酸含量，提升果实品质。