直肠癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p表达变化及其与临床病理特征和预后的关系

汤娜娜，张海玲，蒋波，王晓松，王晓燕

宿迁市第一人民医院消化内科，江苏宿迁 223800

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。据统计，2020年我国结直肠癌新发病例约55.5 万例，正以每年7.4%的速度快速攀升［1］。近年来，随着肿瘤筛查项目不断推广，越来越多结直肠癌患者得以被早发现、早治疗。因此，我国结直肠癌的死亡率已有所下降，但仍远高于欧美发达国家［2］。迄今为止，结直肠癌的发病机制尚未完全阐明，故深入探索结直肠癌发病的分子机制，对早期筛查和研发靶向药物具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一种内源性非编码小RNA 分子，能够在翻译水平上调控多种基因的表达，不仅参与细胞增殖、分化、凋亡等生命活动，还参与肿瘤的发生、发展［3］。miR-144-5p、miR-876-5p 是新近发现的miRNA 家族成员。有研究报道，miR-144-5p在胃癌、甲状腺癌等恶性肿瘤中异常表达［4-5］，miR-876-5p 在膀胱癌、肝癌等恶性肿瘤中异常表达［6-7］。提示miR-144-5p、miR-876-5p 能够参与多种恶性肿瘤的发生、发展。近年研究发现，在结肠癌细胞中miR-144-5p、miR-876-5p异常表达，其异常表达能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移［8-9］。但鲜有二者表达与直肠癌患者临床病理特征和预后关系的报道。本研究探讨了直肠癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p 表达变化及其与临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月—2019年8月宿迁市第一人民医院收治的直肠癌患者85 例（观察组）。直肠癌诊断依据《中国结直肠癌诊疗规范（2015 版）》［10］，并经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合直肠癌诊断标准；②初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；③临床病理资料和术后随访资料完整。排除标准：①合并克罗恩病、溃疡性结肠炎等其他肠道疾病者；②合并其他部位恶性肿瘤者；③年龄＜18 岁者；④合并全身感染性疾病、自身免疫性疾病者；⑤院内死亡者；⑥妊娠期或哺乳期妇女。其中，男48 例、女37 例，年龄44～82（60.18 ±6.15）岁；肿瘤最大径：≥4 cm 42 例，＜4 cm 43 例；组织分化程度：低分化42 例，中高分化43 例；浸润深度：T1、T232 例，T3、T453 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期48 例；有淋巴结转移43 例，无淋巴结转移42 例。同期另选在宿迁市第一人民医院体检健康的志愿者52 例（对照组），男29 例、女23 例，年龄27～78（60.52 ± 5.32）岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经宿迁市第一人民医院伦理委员会批准（审批编号：2019-124），所有研究对象或其家属知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 血清miR-144-5p、miR-876-5p表达检测 观察组入院次日、对照组体检当日，采集清晨空腹外周静脉血3 mL，1 500×g 离心15 min，留取上层血清。采用TRIzol 法提取血清总RNA，经超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA 纯度和浓度合格。按TaKaRa逆转录试剂盒说明将总RNA 逆转录为cDNA。逆转录条件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA 为模板，按SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒说明进行PCR 扩增。所有引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成。miR-144-5p 上游引物5′-CTACGCTCCGT⁃GAGATGTGCT-3′、下游引物5′-TAGCACTCAGTAT⁃GATAACTA-3′，内参U6 上游引物5′-CTCGCTTCG⁃GCACACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATT⁃GCGT-3′；miR-876-5p 上游引物5′-TGAAGTGCTGT⁃GGATTTCTTTGTG-3′、下游引物5′-TGAATTACTTT⁃GTAAACCACCACCA-3′，内参U6 上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′、下游引物5′-GT⁃GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。PCR 反应体系共20.0 μL：SYBR®Premix Ex Taq 10.0 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase Free H2O 6.0 μL；反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40个循环。PCR扩增反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以U6 为内参，采用2-ΔΔCT法计算血清miR-144-5p、miR-876-5p相对表达量。

1.3 随访 直肠癌患者术后通过门诊复查或电话形式定期随访3年，随访截至2022年8月，统计患者死亡情况，计算3年生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。正态分布的计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。预测效能分析采用受试者工作特征（ROC）曲线，曲线下面积（AUC）比较采用Hanley & McNeil 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-144-5p、miR-876-5p表达比较 观察组血清miR-144-5p、miR-876-5p相对表达量分别为1.10 ± 0.22、1.45 ± 0.44，对照组分别为1.84 ±0.42、2.12 ± 0.31。观察组血清miR-144-5p、miR-876-5p 相对表达量均显著低于对照组（t分别为11.786、10.504，P均＜0.05）。

2.2 血清miR-144-5p、miR-876-5p表达与直肠癌患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 血清miR-144-5p、miR-876-5p表达与直肠癌患者临床病理特征的关系

2.3 血清miR-144-5p、miR-876-5p表达与直肠癌患者预后的关系 85 例直肠癌患者共随访5～36 个月，至随访截至日期，死亡20 例，3年生存率为76.47%（65/85）。以血清miR-144-5p、miR-876-5p表达的平均值为界，将直肠癌患者分为miR-144-5p高表达者（miR-144-5p 相对表达量≥1.10）43 例与miR-144-5p 低表达者（miR-144-5p 相对表达量＜1.10）42 例、miR-876-5p 高表达者（miR-876-5p 相对表达量≥1.45）46 例与miR-876-5p 低表达者（miR-876-5p 相对表达量＜1.45）39 例。miR-144-5p 高表达者3年生存率为88.37%（38/43），miR-144-5p 低表达者为64.29%（27/42），miR-144-5p 高表达者3年生存率显著高于miR-144-5p低表达者（χ2=4.368，P＜0.05）；miR-876-5p 高表达者3年生存率为86.96%（40/46），miR-876-5p 低表达者为64.10%（25/39），miR-876-5p 高表达者3年生存率显著高于miR-876-5p低表达者（χ2=4.286，P＜0.05）。

2.4 血清miR-144-5p、miR-876-5p表达对直肠癌患者预后不良的预测价值 ROC 曲线分析显示，血清miR-144-5p 表达预测直肠癌患者预后不良的AUC为0.781（95%CI：0.678～0.864），最佳截断值为1.19，此时其预测直肠癌患者预后不良的灵敏度为95.00%、特异度为46.15%；血清miR-876-5p表达预测直肠癌患者预后不良的AUC为0.795（95%CI：0.694～0.875），最佳截断值为1.51，此时其预测直肠癌患者预后不良的灵敏度为95.00%、特异度为56.92%；血清miR-144-5p、miR-876-5p 表达联合预测直肠癌患者预后不良的AUC为0.888（95%CI：0.801～0.946），其预测直肠癌患者预后不良的灵敏度为90.00%、特异度为78.46%。血清miR-144-5p、miR-876-5p 表达联合预测直肠癌患者预后不良的AUC显著高于血清miR-144-5p、miR-876-5p 表达单独（Z分别为2.320、2.247，P均＜0.05）。见图1。

图1 血清miR-144-5p、miR-876-5p表达预测直肠癌患者预后不良的ROC曲线

3 讨论

直肠癌是一种起源于直肠黏膜上皮的恶性肿瘤。近年来，随着人口老龄化加剧和饮食结构改变，我国直肠癌的发病率和死亡率一直居高不下［1］。尽早发现并及时处理癌前病变和癌前状态是降低直肠癌患者死亡率的关键。但由于直肠癌早期无特异性症状，大多数患者出现典型症状就诊时已进展至中晚期，尽管近年来放化疗、免疫治疗、靶向治疗等取得了重大进展，但中晚期直肠癌极易发生局部扩散和远处转移，即使经积极治疗，预后仍然较差［2］。迄今为止，直肠癌的发病机制尚未完全阐明。因此，深入探索直肠癌发病的分子机制，对其早期筛查和研发靶向药物具有重要意义。

目前，临床主要通过血清甲胎蛋白、癌胚抗原、糖类抗原19-9 等肿瘤标志物评估直肠癌患者预后，但其灵敏度和特异度较低。在肿瘤发生、发展过程中涉及一系列表观遗传学改变，而非编码RNA 在表观遗传学调控中发挥重要作用。miRNA 作为一种内源性非编码小RNA 分子，能够通过与mRNA 的3′端非编码区特定位点结合，与mRNA 完美配对或不完美配对引起mRNA 降解或转录后基因沉默，从而参与肿瘤的发生、发展［3］。miR-144-5p 定位于人17号染色体长臂11.2 处。最初发现miR-144-5p 可参与贫血过程，近年发现miR-144-5p 还参与肿瘤的发生、发展。有研究报道，miR-144-5p在非小细胞肺癌中低表达，通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶1 抑制非小细胞肺癌细胞增殖和细胞周期分布［11］；miR-144-5p 在卵巢癌中低表达，通过靶向La 相关蛋白1抑制卵巢癌细胞上皮间质转化［12］。HAN 等［13］通过miRNA 微阵列分析发现，miR-144-5p 在奥沙利铂化疗抵抗的结直肠癌患者外周血中表达降低。但目前鲜有直肠癌患者外周血miR-144-5p 表达变化的报道。本研究结果显示，观察组血清miR-144-5p 表达显著低于对照组；血清miR-144-5p 表达与直肠癌浸润深度、TNM 分期和淋巴结转移有关，而与性别、年龄、肿瘤最大径、组织分化程度无关。结果表明，miR-144-5p能够参与直肠癌的发生、发展，其机制可能与miR-144-5p表达下调能够上调环指蛋白187表达有关。环指蛋白187 是含RING 域的E3 泛素连接酶，能够通过与底物偶联作用促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移［14］。

miR-876-5p 定位于人9 号染色体短臂21.1 处。近年研究发现，miR-876-5p 能够参与多种恶性肿瘤的发生、发展。有研究报道，miR-876-5p在髓母细胞瘤中低表达，并通过靶向叉头盒蛋白M1 抑制髓母细胞瘤细胞增殖和侵袭［15］；miR-876-5p 在卵巢癌细胞中高表达，并通过靶向F-box 蛋白31 促进卵巢癌细胞生长和侵袭［16］。这些研究表明miR-876-5p 在不同肿瘤中发挥的作用不同。本研究结果显示，观察组血清miR-876-5p 表达显著低于对照组；血清miR-876-5p 表达与直肠癌浸润深度、TNM 分期和淋巴结转移有关，而与性别、年龄、肿瘤最大径、组织分化程度无关。结果表明，miR-876-5p 亦参与直肠癌的发生、发展，其机制可能与miR-876-5p 表达下调能够导致Ras 蛋白激活剂样2 表达上调有关。Ras蛋白激活剂样2 是一种GTP 结合蛋白，可通过抑制促进Yes 相关蛋白去磷酸化激活的Yes 相关蛋白信号通路，促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移［17］。

本研究结果发现，miR-144-5p、miR-876-5p 高表达者3年生存率均显著高于其低表达者。表明血清miR-144-5p、miR-876-5p 表达与直肠癌患者预后密切相关，有望成为评估直肠癌患者预后的潜在生物标志物。本研究ROC曲线分析发现，血清miR-144-5p、miR-876-5p 表达预测直肠癌患者预后不良的AUC分别为0.781、0.795，提示血清miR-144-5p、miR-876-5p表达对直肠癌患者预后不良均具有一定预测价值；血清miR-144-5p、miR-876-5p表达联合预测直肠癌患者预后不良的AUC为0.888，高于血清miR-144-5p、miR-876-5p表达单独，提示血清miR-144-5p、miR-876-5p表达联合能够提高对直肠癌患者预后不良的预测价值。

综上所述，直肠癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p 低表达，二者表达与肿瘤浸润深度、TNM 分期、淋巴结转移以及患者预后密切相关，并可作为预测直肠癌患者预后不良的生物标志物。