呼吸道合胞病毒肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达变化及其临床意义

薛亚琪，沙宁，武怡

1 徐州医科大学附属淮安医院 淮安市第二人民医院儿科，江苏淮安 223002；2 徐州医科大学附属医院儿科

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球范围内引起5 岁以下儿童急性下呼吸道感染的主要病原体［1］。RSV感染后可引起患儿反复喘息发作，如不及时治疗可导致感染性肺炎或细支气管炎，严重者甚至死亡［2］。目前，临床尚无疫苗或有效的抗病毒药物治疗RSV感染。因此，寻找能够早期诊断RSV 感染的血清生物标志物具有重要意义。干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）是一种干扰素刺激因子，能够阻止甲型流感病毒、埃博拉病毒等通过磷脂双分子层进入细胞，具有高效、广谱抗病毒能力［3-4］。干扰素诱导蛋白27（IFI27）也是一种干扰素刺激因子，能够激活RNA聚合酶Ⅱ的DNA结合转录活性，从而参与细胞蛋白质代谢、病毒感染防御反应及凋亡信号调节等病理生理过程［5］。近年研究发现，RSV 肺炎患儿血清IFITM3、IFI27等基因表达差异显著，这些差异表达基因有可能成为预测RSV 感染的血清生物标志物［6-7］。本研究探讨了RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达变化及其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年1月—2021年12月淮安市第二人民医院收治的RSV 肺炎患儿90例（观察组）。病毒性肺炎诊断依据《儿童病毒性肺炎中西医结合诊治专家共识（2019年制定）》［8］，具有咳嗽、气喘、呼吸困难等临床表现，肺部有中细湿啰音和呼气相哮鸣音，胸片肺间质浸润影或斑片影，外周血白细胞总数多正常、中性粒细胞比例不高，经鼻咽部或咽拭子等病原学检查明确RSV 感染。纳入标准：①符合RSV 肺炎诊断标准；②年龄3～10岁；③临床病历资料完整。排除标准：①伴自身免疫性疾病者；②合并哮喘、先天性气道或肺结构发育异常者；③合并肺结核或其他病原体导致的肺部感染者；④近3个月内存在肺部急慢性感染性疾病者；⑤近2周内使用类固醇激素者。其中，男50 例、女40 例，年龄（5.35 ±0.87）岁，BMI（17.47 ± 2.58）kg/m2，病程2～21（7.42 ±1.2）d，病情程度：低危［肺炎严重程度指数（PSI）评分［9］＜90分］28例、中危（RSI评分90～＜130分）30例、高危（RSI评分≥130分）32例。选择同期淮安市第二人民医院收治的腹股沟斜疝患儿40例（对照组），既往无免疫缺陷性疾病，近3个月内无急慢性感染性疾病。其中，男24 例、女16 例，年龄（5.31 ± 0.89）岁，BMI（17.54 ± 2.64）kg/m2。两组性别、年龄、BMI 具有可比性。本研究经淮安市第二人民医院伦理委员会批准（审批文号：HEYLL202216），所有患儿监护人知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达检测 观察组入院当日，对照组入院次日，采集肘静脉血3 mL，置于肝素抗凝的采血管中，按体积比1∶1加入生理盐水，充分振荡混匀。取Ficoll 淋巴细胞分离液3 mL，置于15 mL灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45°，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，室温下3 000 r/min离心30 min、离心半径10 cm，离心管由上至下分为四层。用吸管将单个核细胞层吸出，转移至另一15 mL灭菌离心管中。然后向该离心管中加入清洗液10 mL，室温下3 000 r/min 离心10 min、离心半径10 cm。吸弃上清液，加入清洗液0.5 mL 重悬，-80 ℃冰箱保存。取单个核细胞悬液0.5 mL，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经NanoDrop 2000超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA 浓度和纯度合格。按逆转录酶试剂盒说明，将总RNA 逆转录为cDNA。逆转录条件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 45 min。以cDNA 为模板，按2×SYBR Green qPCR Master Mix荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：IFITM3 上游引物5′-CCACATCATCCAACATCCTCC-3′、下游引物5′-TCATCTTCTTTAGCCTCGGGTT-3′，IFI27上游引物5′-CTGTGGTCGGAGGAGTTGTG-3′、下游引物5′-GGCGATTCCTACTGAGGTGAA-3′，β-actin 上游引物5′-TGCTCTCACCTCATCAGCAGT-3′、下游引物5′-CACAACTCCTCCAATCACAACT-3′。PCR 反应体系共20 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，双蒸水4 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min 共40 个循环。PCR 反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值（CT）数。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算IFITM3、IFI27 相对表达量。

1.3 血清炎症因子检测 观察组入院当日，对照组入院次日，采集肘静脉血3 mL，静置30 min 后，3 000 r/min离心10 min、离心半径10 cm，分离血清。采用ELISA 法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ。检测仪器为ReadMax 1200 型光吸收全波长酶标仪。ELISA 试剂盒购自上海科艾博生物技术有限公司。所有操作严格按照仪器操作规程和试剂盒说明进行。

1.4 肺功能检查 所有研究对象入院次日，取端坐位，平静状态下5 min 后，采用AS-507 型肺功能检测仪检测肺功能，包括第1 秒用力呼气容积占预计值的百分比（FEV1%pred）、FEV1/用力肺活量（FVC）。1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；两组间比较采用独立样本t检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。预测效能分析采用受试者工作特征（ROC）曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达比较 观察组外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 相对表达量分别为2.46 ± 0.38、2.29 ± 0.23，对照组分别为1.21 ± 0.30、0.91 ± 0.13。观察组外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 相对表达量均显著高于对照组（t分别为18.398、35.464，P均＜0.01）。不同病情程度RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达比较见表1。

表1 不同病情程度RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27相对表达量比较（±s）

表1 不同病情程度RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27相对表达量比较（±s）

注：与低危比较，*P＜0.05；与中危比较，＃P＜0.05。

RSV肺炎病情程度高危中危低危n IFI27 2.46 ± 0.24*＃2.28 ± 0.23*2.15 ± 0.21 14.081＜0.01 32 30 28 F P IFITM3 2.83 ± 0.40*＃2.45 ± 0.36*2.14 ± 0.39 24.434＜0.01

2.2 两组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平及FEV1%pred、FEV1/FVC 比较 观察组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平均显著高于对照组，FEV1%pred、FEV1/FVC 均显著低于对照组（P均＜0.01），见表2。不同病情程度RSV 肺炎患儿血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比较见表3。

表2 两组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比较（±s）

表2 两组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比较（±s）

组别对照组观察组n 40 90 t P IL-1β（pg/mL）11.02 ± 3.93 34.39 ± 5.44 24.458＜0.01 IL-6（pg/mL）21.32 ± 4.47 65.58 ± 7.98 32.819＜0.01 TNF-α（pg/mL）7.42 ± 1.61 18.61 ± 3.91 17.425＜0.01 IFN-γ（pg/mL）230.41 ± 22.81 280.14 ± 21.18 12.066＜0.01 FEV1%pred（%）96.81 ± 17.30 81.46 ± 15.32 5.065＜0.01 FEV1/FVC（%）93.51 ± 26.60 72.21 ± 23.29 4.604＜0.01

表3 不同病情程度RSV肺炎患儿血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比较（±s）

表3 不同病情程度RSV肺炎患儿血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平及FEV1%pred、FEV1/FVC比较（±s）

注：与低危比较，*P＜0.05；与中危比较，＃P＜0.05。

RSV肺炎病情程度高危中危低危n 32 30 28 F P FEV1/FVC（%）60.87 ± 23.29*＃71.55 ± 23.40*85.87 ± 24.20 8.394＜0.01 IL-1β（pg/mL）52.22 ± 5.14*＃33.27 ± 5.30*24.18 ± 5.96 208.531＜0.01 IL-6（pg/mL）71.00 ± 7.60*＃66.56 ± 7.84*58.33 ± 8.12 19.834＜0.01 TNF-α（pg/mL）21.94 ± 3.71*＃19.06 ± 3.86*14.32 ± 4.25 28.313＜0.01 IFN-γ（pg/mL）295.75 ± 23.15*＃279.06 ± 20.25*267.49 ± 21.20 130.028＜0.01 FEV1%pred（%）72.83 ± 14.85*＃82.17 ± 15.21*90.56 ± 16.24 9.931＜0.01

2.3 RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平及FEV1%pred、FEV1/FVC 的关系 Pearson 相关分析显示，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3 表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相关关系（r分别为0.472、0.503、0.401、0.662，P均＜0.01），与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈负相关关系（r分别为-0.536、-0.479，P均＜0.05）；外周血单个核细胞IFI27 表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相关关系（r分别为0.428、0.397、0.458、0.634，P均＜0.01），与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈负相关关系（r分别为-0.527、-0.603，P均＜0.05）。

2.4 外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达对RSV肺炎的预测价值 ROC 曲线分析显示，外周血单个核细胞IFITM3 表达预测RSV 肺炎的曲线下面积（AUC）为0.756（95%CI：0.658～0.853），其最佳截断值为2.30，此时其预测RSV 肺炎的灵敏度为64.2%、特异度为78.2%、约登指数为0.424；外周血单个核细胞IFI27 表达预测RSV 肺炎的AUC为0.763（95%CI：0.710～0.925），其最佳截断值为2.15，此时其预测RSV 肺炎的灵敏度为55.9%、特异度为82.3%、约登指数为0.382；外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达联合预测RSV 肺炎的AUC为0.837（95%CI：0.750～0.927），其预测RSV 肺炎的灵敏度为85.5%、特异度为78.0%、约登指数为0.635。外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达联合预测RSV 肺炎的AUC高于外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达单独（Z分别为2.096、2.115，P均＜0.05）。

3 讨论

临床上，大多数RSV 感染具有自限性，但仍有部分RSV 感染可引起肺炎或细支气管炎，需住院治疗。目前，RSV肺炎的发生机制尚不完全清楚，临床亦无疫苗或有效的抗病毒药物治疗RSV 感染。因此，寻找能够早期诊断RSV 感染的血清生物标志物具有重要意义。

干扰素刺激基因是由干扰素诱导表达的基因，在宿主抵抗病毒感染过程中发挥至关重要的作用［10］。既往有研究筛选了RSV 肺炎患儿外周血差异表达基因，发现IFITM3、IFI27 基因表达显著上调，二者均能参与抗病毒感染免疫反应，有可能成为RSV感染新的生物标志物［7］。IFITM3基因定位于人11 号染色体，其编码蛋白可参与干扰素调节以及免疫反应、细胞周期等过程调控。近年研究发现，IFITM3 还具有广谱抗病毒作用，如人类免疫缺陷病毒、埃博拉病毒等［3］。本研究结果发现，观察组外周血单个核细胞IFITM3相对表达量显著高于对照组，并且随着病情程度加重，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3 相对表达量逐渐升高。结果提示IFITM3 可能参与RSV 肺炎的发生、发展。究其原因，RSV 感染后，病毒侵入气道上皮细胞、肺泡巨噬细胞和树突状细胞等，刺激其分泌IFN-γ，直接诱导干扰素刺激基因IFITM3表达，进而诱导机体适应性免疫反应。此外，RSV 感染后可刺激机体免疫细胞产生大量趋化因子、细胞因子等，诱导炎症级联反应，加重肺组织炎症损伤。本研究结果发现，RSV肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3 表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均呈正相关关系。有研究表明，IFITM3 能够与囊泡膜相关蛋白A 相互作用，干扰囊泡膜相关蛋白A与胆固醇结合蛋白结合，将大量胆固醇迁移并聚集至晚期内涵体和含病毒粒子的囊泡，阻止病毒包膜和内涵体膜融合，抑制病毒入侵；IFITM3 过表达则可导致膜胆固醇含量增加，降低膜流动性，从而影响病毒融合，抑制病毒通过细胞膜进入细胞［11］。有研究还发现，Ⅰ型干扰素能够促进IFITM3 表达，抑制吞噬体成熟和蛋白水解过程，促进病原体的吞噬体逃逸和细胞间扩散，抑制免疫细胞募集并诱导促炎症细胞因子释放，从而加重病情［12］。因此，随着RSV 肺炎患儿病情加重，外周血单个核细胞IFITM3 表达逐渐升高。本研究结果还发现，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3 表达与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈负相关关系，提示RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3 表达与肺功能密切相关。其原因可能是外周血单个核细胞IFITM3 表达升高能够通过促进肺组织炎症细胞因子分泌，引起肺部炎症反应和肺组织损伤，导致RSV肺炎患儿肺功能损伤［12］。

IFI27 又称干扰素刺激基因12，可参与调节免疫、IFN-γ 信号传导及脂质代谢等生物学过程，具有抗病毒或细菌感染作用［13-14］。近年研究发现，IFI27能够抑制人类自身免疫缺陷病毒、肠道病毒71等复制［6，15］。本研究结果发现，观察组外周血单个核细胞IFI27相对表达量显著高于对照组，并且随着病情程度加重，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3 相对表达量逐渐升高。结果提示IFI27 亦能参与RSV肺炎的发生、发展。RSV感染可激活气道上皮细胞、肺泡巨噬细胞分泌IFN-γ，而IFN-γ 能够直接促进IFI27 表达［6］。本研究结果发现，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFI27表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平均呈正相关关系。有研究表明，IFI27 能够与多聚腺苷酸胞质结合蛋白1 相互作用，通过抑制其细胞核定位进而抑制其转录活性，促进CXC 趋化因子配体10表达，招募大量巨噬细胞分泌促炎症细胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，加重肺组织损伤［16-17］。本研究结果还发现，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFI27 表达与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈负相关关系，提示RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFI27 表达与肺功能密切相关。有研究发现，IFI27 可通过诱导孤儿核受体亚家族4A1 由细胞质向细胞核移位，促进单核巨噬细胞中Th1 型细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌，进而加重肺组织损伤［6，18］。

本研究ROC 曲线分析发现，外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达单独和联合预测RSV肺炎的AUC分别为0.756、0.763、0.837，外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达联合预测RSV 肺炎的AUC高于外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达单独。结果提示外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达对RSV肺炎均有一定预测价值，二者联合预测价值更高。

综上所述，RSV 肺炎患儿外周血单个核细胞IFITM3、IFI27表达显著升高，二者表达与血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ 水平均呈正相关关系，与FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈负相关关系；外周血单个核细胞IFITM3、IFI27 表达对RSV 肺炎均有一定预测价值，二者联合预测价值更高。