穿心莲内酯对口腔鳞状细胞癌体内外抑制作用的实验研究

吕艳利 巴 凯 方 政 商留珂（洛阳职业技术学院口腔医学，洛阳 471000）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是指发生于口腔内的恶性肿瘤，具有高复发率和转移率［1］。据统计，OSCC五年生存率仅有40%～50%，且发病迅速，预后极差，严重影响人们生命健康和生活质量［2］。目前，国内外针对OSCC的临床治疗方法主要有手术治疗、放化疗、基因靶向治疗和中医中药辅助治疗等［3-5］。穿心莲内酯是天然植物穿心莲的有效成分，难溶于水，具有祛热解毒、消炎止痛之功效，对细菌或病毒性上呼吸道感染有治疗作用［6］。研究表明，穿心莲内酯在多种肿瘤发生发展过程中发挥调控作用，如穿心莲内酯通过上调死亡受体4（DR4）促进人肾癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡敏感，穿心莲内酯通过ROS/JNK途径诱导人骨肉瘤细胞凋亡，穿心莲内酯通过提高活性氧水平使Hep-2人喉癌细胞对卡铂诱导的细胞凋亡敏感等［7-9］。但穿心莲内酯在OSCC体内外的研究鲜见报道，因此，本研究旨在通过细胞水平及动物水平研究穿心莲内酯在OSCC体内外的影响作用，为穿心莲内酯在OSCC诊断与治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物、试剂及仪器 穿心莲内酯（纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司；OSCC细胞系CAL-27由中国科学院上海细胞库提供；胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司；CCK8试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、RT-PCR试剂盒和Hoechst染色试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司；PI单染细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天公司；免疫组化试剂盒购自美国Invitrogen公司；caspase-9兔多克隆抗体、caspase-3兔多克隆抗体、cleaved PARP兔单克隆抗体、上皮型钙黏蛋白（Ecadherin）兔单克隆抗体、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）兔单克隆抗体、波形蛋白（Vimentin）兔多克隆抗体和TGF-β1兔单克隆抗体均购自美国Abcam公司。

RT-PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司，东胜龙ETC811）；台式高速离心机（大龙，D3024R），酶标仪（Rayto，RT6100）；光学显微镜（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；成像系统（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R）。

1.1.2动物 雄性BALB/c小鼠（6周龄，体质量20～25 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，使用许可证号：SYXK（京）2017-0022。动物饲养条件：每只小鼠给予24 h昼夜灯光照射控制及严格、规范的卡片登记管理，24℃条件下独立饲养，适应性喂养1周后进行后续实验。

1.2方法

1.2.1动物建模及给药 将小鼠分为对照组、25 mg/kg穿心莲内酯组、50 mg/kg穿心莲内酯组和100 mg/kg穿心莲内酯组。建模：OSCC细胞系CAL-27以5×106个/ml皮下注射小鼠建立移植瘤裸鼠模型，实验给药组参照文献［10］分别灌胃给药25、50、100 mg/kg的穿心莲内酯，4周后分离各组小鼠移植瘤组织并称取肿瘤重量。

1.2.2CCK8检测细胞活力 细胞培养：用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，5%CO2、37℃细胞培养箱中静置培养，待细胞生长密度达80%且生长状态良好时进行传代培养。收集对数生长期且生长状态良好的CAL-27细胞，按每孔50µl 5×106个/ml接种至96孔板，每组3个复孔，除空白对照孔外，其余孔加入不同浓度（7.5、15和30µmol/L）的穿心莲内酯。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。培养后每孔加入10 µl CCK8试剂避光孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光值，计算公式：细胞活力（%）=各浓度给药组的A值/空白组的平均A值×100%。

1.2.3流式细胞术检测CAL-27细胞周期变化 取对数生长期且生长状态良好的CAL-27细胞以1×104个/孔接种于6孔板，每组3个复孔，除空白对照孔外，其余孔加入不同浓度（7.5µmol/L、15µmol/L和30 µmol/L）的穿心莲内酯，培养48 h后用胰蛋白酶进行消化处理各组细胞，1×PBS溶液浸洗2次，移至1.5 ml离心管中，加入预冷的70%乙醇固定细胞，4℃过夜。用冷PBS清洗细胞2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入1 ml PI染液，轻轻振荡混匀，室温下避光孵育30 min，流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.4克隆形成实验检测克隆形成率 收集各组生长状态良好的CAL-27细胞，经胰酶消化处理后，将各组1×102个细胞接种至6孔板，待6孔板中出现肉眼可见的细胞克隆时，弃培养液并用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，再加入适量的吉姆萨染液染色10～20 min，根据克隆形成数计算克隆形成率，克隆形成率（%）=（细胞克隆数/100）×100%。

1.2.5RT-PCR检 测PCNA和p21 mRNA表 达 水平 收集对数生长期的CAL-27细胞并制备细胞悬液，用TRIzol试剂盒提取总RNA，分光光度计测定RNA浓度和纯度，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA（25℃逆转录15 min，37℃逆转录10 min，85℃灭活5 s），然后按照RT-PCR试剂盒配制反应体系，在PCR扩增仪上进行扩增（95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸2 min，循环40次后，72℃延伸5 min）。以目的基因和内参比值表示mRNA相对表达水平，采用2-ΔΔCt法分析结果。PCNA正 向 引 物：5'-TAAGGGCTGGAAGATAATGCTGAT-3'，反向引物：5'-CCTGTTCTGGGATTCCAAGTT-3'；p21正向引物：5'-CGCGGATCCCCTCTCACCCTAAGGGT-3'，反向引物：5'-CCGCTCGAGCCCTGCACCTCCTCGTC-3'；GADPH正向引物：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，反向引物：5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'；caspase-3正向引物：5'-TGGTTCATCCAGTCGCTTTGT-3'，反向引物：5'-CAAATTCTGTTGCCACCTTTCG-3'。

1.2.6Hoechst染色观察细胞形态变化 收集生长状态良好的CAL-27细胞，4℃、3 000 r/min条件下离心细胞，用1.5 ml离心管收集细胞样品，加入0.5 ml固定液，制备细胞悬液，固定10 min后弃固定液，用PBS洗涤后，将细胞样品液均匀铺于载玻片上，待玻片晾干后，滴加0.5 ml Hoechst染色液染色5～10 min。待晾干后，用PBS洗涤，滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，用荧光显微镜观察细胞，细胞核呈蓝色。

1.2.7Western blot检测caspase-9、caspase-3、cleaved PARP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白表达水平 收集各组CAL-27细胞，胰酶消化细胞后制成细胞悬液，4℃、3 000 r/min离心15 min，取上清。用RIPA蛋白裂解液于冰上提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经SDSPAGE凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，加入caspase-9（1∶500）、caspase-3（1∶500）、cleaved PARP（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和TGF-β1（1∶1 000），4℃孵育摇床过夜。加入按比例稀释的HRP标记的对应二抗（1∶10 000），室温避光孵育2 h。采用ECL进行化学发光法于暗室下曝光显影，将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件分享光密度值。

1.2.8免疫组化检测Ki67、caspase-3和Vimentin阳性表达率 按0Envision二步法和免疫组化检测试剂盒（PV-6000）说明操作，将石蜡切片脱蜡至水，室温孵育5～10 min，用柠檬酸抗原修复缓冲液（pH=6.0）进行抗原修复，切片放入3%H2O2溶液中室温避光孵育25 min以阻断内源性过氧化物酶，BSA封闭30 min，加入一抗孵育过夜，加二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50 min，DAB显色，苏木精复染。用PBS代替一抗作阴性对照。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出来的阳性信号为棕黄色。

1.3统计学处理 所有实验独立重复3次，取平均值，数据处理使用SPSS21.0软件进行分析，正态分布的计量资料表示为±s。采用单因素方差分析，若方差齐则两两比较采用LSD法，若方差不齐则两两比较采用Dunnett-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1穿心莲内酯对OSCC细胞活力的影响CCK8检测OSCC细胞活力，0.75、1.5、3、7.5µmol/L穿心莲内酯处理OSCC CAL-27后，细胞活力无明显变化。15、30µmol/L穿心莲内酯处理CAL-27后，细胞活力显著降低（P＜0.05）。60、120、240、480 µmol/L穿心莲内酯显著降低CAL-27细胞活力，且细胞活力极低，见图1。本实验选择0、7.5、15、30 µmol/L的穿心莲内酯进行后续实验，探究穿心莲内酯对OSCC细胞的影响作用。

图1 CCK8检测细胞活力Fig.1 CCK8 was employed to detect cell viability

2.2穿心莲内酯对OSCC细胞增殖的影响PI单染法检测CAL-27细胞周期变化，与0µmol/L穿心莲内酯组比较，7.5µmol/L穿心莲内酯组细胞G0～G1期细胞占比差异无统计学意义（P＞0.05），15 µmol/L和30µmol/L穿心莲内酯组G0-G1期细胞占比显著上升（P＜0.05），见图2A，提示穿心莲内酯可将CAL-27细胞增殖周期阻滞在G0～G1期。克隆形成实验检测细胞克隆形成率，与0 µmol/L穿心莲内酯组比较，

7.5µmol/L穿心莲内酯组细胞克隆形成率差异无统计学意义（P＞0.05），15、30µmol/L穿心莲内酯组细胞克隆形成率显著降低（P＜0.05），见图2B、C。RTPCR检测PCNA和p21 mRNA表达水平，与0µmol/L穿心莲内酯组比较，7.5µmol/L穿心莲内酯组细胞PCNA和p21 mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），15、30 µmol/L穿心莲内酯组细胞中PCNA mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），p21 mRNA水平显著增高（P＜0.05），见图2D。

图2 穿心莲内酯对OSCC细胞增殖的影响Fig.2 Effect of andrographolide on proliferation of OSCC cells

2.3穿心莲内酯对OSCC细胞凋亡的影响Hoechst染色观测细胞形态变化，0、7.5µmol/L穿心莲内酯组细胞形态正常，胞核呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒，未见凋亡细胞。15、30 µmol/L穿心莲内酯组细胞胞核呈亮蓝色，核呈分叶，碎片状，边集，可见大量凋亡细胞，见图3A。与0µmol/L穿心莲内酯组比较，7.5 µmol/L穿心莲内酯组cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3和cleaved PARP蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05），15µmol/L和30 µmol/L穿 心 莲 内 酯 组cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3和cleaved PARP蛋白水平显著提高（P＜0.05），图3B。

图3 Hoechst染色和Western blot检测细胞凋亡（Hoechst×200）Fig.3 Apoptosis detected by Hoechst and Western blot（Hoechst×200）

2.4穿心莲内酯对OSCC细胞EMT标志蛋白水平的影响 与0µmol/L穿心莲内酯组比较，7.5µmol/L穿心莲内酯组细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05），15、30 µmol/L穿心莲内酯组细胞中E-cadherin蛋白水平显著增高（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图4。

图4 Western blot检 测 细 胞 中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白水平Fig.4 Expression levels of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin and TGF-β1 protein in cells were detected by Western blot

2.5穿心莲内酯对移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响测量肿瘤重量，与对照组比较，25 mg/kg穿心莲内酯组肿瘤重量差异无统计学意义（P＞0.05），50、100 mg/kg穿心莲内酯组肿瘤重量显著降低（P＜0.05）。免疫组化检测caspase-3、Vimentin和Ki67表达量。与对照组比较，25 mg/kg穿心莲内酯组caspase-3、Vimentin和Ki67表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），50、100 mg/kg穿心莲内酯组caspase-3表达量显著增高（P＜0.05），Vimentin和Ki67表达量显著降低（P＜0.05），见图5。

图5 免疫组化检测caspase-3、Vimentin和Ki67表达量Fig.5 Immunohistochemical detection of caspase-3，Vimentin and Ki67 expression levels

3 讨论

本研究利用浓度梯度穿心莲内酯处理OSCC细胞系CAL-27，检测穿心莲内酯对OSCC活力、增殖、凋亡及EMT过程的影响。同时，本研究还利用OSCC皮下注射BALB/c小鼠建立移植瘤裸鼠模型，观测肿瘤生长。研究结果显示，经穿心莲内酯给药处理后，OSCC细胞活力显著降低，癌细胞克隆形成率显著降低，凋亡细胞明显增多，运动能力显著被抑制，且肿瘤生长明显被抑制。结果提示，穿心莲内酯在OSCC中具有调节作用。

癌细胞异常增殖是促进癌细胞发生发展进程的重要因素，因此，抑制癌细胞增殖能有效调控癌细胞发生发展过程。增殖细胞核抗原（PCNA）是一种细胞增殖标志物，只存在于正常增殖细胞和肿瘤细胞中，与启动细胞增殖、DNA合成等过程有关［11］。P21是细胞周期素依赖性激酶抑制因子，与肿瘤抑制作用密切相关，还通过抑制周期素依赖激酶复合物活性协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，有研究报道，P21在OSCC细胞中的表达水平与癌细胞发生发展过程密切相关［12］。本研究结果显示，经穿心莲内酯给药处理后，OSCC细胞克隆形成率显著降低，PCNA表达水平明显降低，P21表达水平明显增高，结果提示，穿心莲内酯能够抑制OSCC细胞增殖。

细胞凋亡是指为维持机体内环境稳定性，由基因控制的细胞程序性死亡过程。凋亡发生时，上游细胞凋亡起始蛋白caspase-9诱导并活化下游细胞凋亡执行蛋白caspase-3，凋亡蛋白caspase-3和caspase-9被异常激活，使得大脑组织产生大量的cleaved cas-3和cleaved cas-9，并进一步执行DNA裂解及细胞凋亡过程［13］。本研究结果显示，OSCC经穿心莲内酯处理后，凋亡细胞明显增多，caspase-9和caspase-3蛋白水平显著上调，结果提示，穿心莲内酯通过上调caspase-9和caspase-3蛋白表达诱导OSCC凋亡。

EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的过程，是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在EMT过程中发挥重要调控作用［14］。Ecadherin通过促进细胞间黏附性和极性抑制癌细胞侵袭转移，N-cadherin与E-cadherin相反，N-cadherin通过减弱细胞间的黏附性和极性促进癌细胞侵袭和转移等过程，Vimentin是维持细胞骨架完整性的一种重要中间丝蛋白［15］。TGF-β1是促进癌细胞侵袭转移的重要特征因子［16］。大量研究表明，OSCC细胞侵袭和转移能力强弱与EMT过程有关［17-18］。因此，本研究通过检测OSCC细胞中EMT标记蛋白水平，结果发现，OSCC细胞中E-cadherin蛋白低表达，N-cadherin和Vimentin蛋白高表达，经穿心莲内酯处理后，E-cadherin蛋白水平显著上调，N-cadherin和Vimentin蛋白水平显著下调，结果提示，穿心莲内酯通过调控E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平抑制OSCC细胞迁移和侵袭能力。

为进一步验证穿心莲内酯在OSCC中的作用，利用OSCC细胞皮下注射小鼠，建立移植瘤裸鼠模型，观测穿心莲内酯对裸鼠肿瘤生长的影响。结果显示，经穿心莲内酯灌胃给药治疗后，移植瘤裸鼠肿瘤重量明显降低，免疫组化结果显示，增殖细胞相关抗原Ki67和Vimentin阳性细胞明显减少，caspase-3阳性细胞增多，与前期细胞水平中观测到的结果相符合。结果提示，穿心莲内酯在体内外均能抑制OSCC生长。

综上所述，穿心莲内酯对OSCC生长具有抑制作用，其具体作用机制尚不明确，后续实验计划进一步探讨穿心莲内酯抑制OSCC生长的作用机制，为穿心莲内酯的临床应用提供更加充分的理论基础。