丹参酮ⅡA对大鼠创面愈合瘢痕增生的抑制作用

陶 冶，张 瑱，周水勇，卫艳萍

1.郑州人民医院整形外科，郑州 450003；2.焦作市人民医院皮肤科，焦作 454002

增生性瘢痕(HS)是创伤修复的必然产物，严重影响机体的正常功能及美观[1]。目前普遍采用的治疗方法有激光烧灼、冷冻、放射、药物注射等。丹参酮是从传统中药丹参根中提取的一类脂溶性二萜类成分，具有抗肿瘤、抗菌消炎、抑制血小板聚集、保护心脑血管等作用[2]。丹参酮ⅡA(TanⅡA)是丹参的主要有效成分之一，具有明显的抗炎作用[3]，本研究构建大鼠背部皮肤创面动物模型，探讨Tan ⅡA对大鼠创面愈合瘢痕增生的抑制作用及可能的机制，为Tan ⅡA相关药物的研发及创面愈合的临床治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

7500HT型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；PowerPac电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Cheni Doc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；RM2235型徕卡切片机(德国徕卡显微系统贸易公司)。

1.2 试药

Tan ⅡA(质量分数≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)；转化生长因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒均购自美国R&D公司；BCA蛋白定量分析试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)；逆转录试剂盒(日本Takara公司)；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(上海欣百诺生物科技有限公司)；白介素-10(IL-10)、粒-单系祖细胞集落刺激因子(GM-CSF)一抗均购自美国Abcam公司。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠120只，10周龄，体质量(200±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2019-0009。实验前适应性饲养5 d。

2 方法

2.1 大鼠模型建立

取96只大鼠建立创面动物模型。用30 mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉大鼠，根据陈志勇等[4]的方法并加以改进，以俯卧位固定大鼠，剔除背部被毛，酒精消毒，用经消毒的打孔器在脊柱两侧制造2×2个直径为10 mm的圆形创口，间隔1 cm，创口深及筋膜层，裸露不缝合，分笼饲养，不禁食水，创面自然愈合。将建模成功的大鼠随机分为模型组及Tan ⅡA低、中和高剂量组，各24只，剩余24只未建立创面模型的大鼠作为对照组。

2.2 干预方法

Tan ⅡA溶于二甲基亚砜(DMSO)，术后30 min Tan ⅡA低、中和高剂量组分别按100、200、300 mg·kg-1剂量溶于DMSO，腹腔注射10 mL，对照组、模型组腹腔注射DMSO 10 mL[5]。每日1次，连续处理14 d。

2.3 一般指标观察

第3、7和14天注射后1 h，每组各取3只大鼠，用涤纶投影薄膜覆盖大鼠创面，扫描图像计算创面面积，作为愈合面积。并记录各组大鼠创面愈合时间，求平均值。

2.4 组织学观察

分别于第3、7和14天注射后1 h，每组各取5只大鼠，用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉，模型组、Tan ⅡA各剂量组无菌剪取创面组织，对照组在脊柱两侧切取同等面积皮肤，用质量浓度100 g·L-1中性甲醛固定48 h，酒精梯度脱水，石蜡包埋后，制作4 μm的连续切片，常规HE染色，于显微镜下观察瘢痕组织病理学变化，计算瘢痕增生指数(hyperplasia index, HI)。HI=瘢痕最高点到软骨的垂直距离/正常皮肤到软骨的距离。计数瘢痕中单位面积的成纤维细胞数量(number of fibroblasts in unit area, NA)。

2.5 ELISA检测TGF-β1、TNF-α水平

分别于第3、7和14天注射后1 h，无菌取各组8只大鼠创面组织50 mg，加入PBS 1 mL匀浆，以8 000 r·min-1离心10 min(离心半径为10 cm)，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行检测，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值(A)，根据样品吸光度值计算样品TGF-β1、TNF-α的质量浓度。

2.6 RT-qPCR检测mRNA表达

分别于第3、7和14天注射后1 h，无菌取各组8只大鼠创面组织置于液氮中研磨并低温保存，各组取50 mg创面组织用Trizol法提取总RNA，测定RNA质量及质量浓度，逆转录获得互补链cDNA，严格按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书操作，在荧光定量PCR仪上检测IL-10和GM-CSF mRNA表达水平的变化。反应体系：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，加DEPC水定容至20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，共40个循环；以2-△△CT为目的基因IL-10、GM-CSF的相对表达强度，实验重复3次取Ct平均值。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot检测蛋白表达水平

取各组2.6项下低温保存的创面组织100 mg，加入RIPA 0.6 mL匀浆并摇匀，静置5 min，重复3次，于离心机离心10 min(4 ℃, 12 000 r·min-1)，取上清用BCA试剂盒进行蛋白定量，取样本20 μg与等量上样缓冲液混匀后进行SDS-PAGE电泳，100 V电转30 min，转至PVDF膜上，加入适量封闭液封闭2 h(室温)，将膜放入1∶1 000稀释的IL-10、GM-CSF一抗中，置于摇床中孵育过夜(4 ℃)，TBST洗膜3次×10 min，放入1∶2 000稀释的二抗中，置于摇床中孵育1 h(室温)，TBST洗膜3次×10 min，将PVDF膜置于显影区，均匀滴加显影液，用滤纸吸除PVDF膜周边多余的显影液，设置显影条件，于暗室中进行曝光、显影，用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带/内参β-actin蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 创面愈合面积、愈合时间比较

Tan ⅡA不同剂量组创面愈合时间均短于模型组(P<0.05)；注射3、7和14 d后，Tan ⅡA不同剂量组愈合面积大于模型组(P<0.05)；创面愈合面积与Tan ⅡA呈剂量依赖性增加，愈合时间与Tan ⅡA呈剂量依赖性缩短(P<0.05)；各组愈合面积随着时间的延长而增加(P<0.05)。见表2。

表2 创面组织愈合面积、愈合时间比较

3.2 创面病理组织学观察及HI、NA比较

注射3、7 d Tan ⅡA不同剂量组HI、NA均较模型组增加(P<0.05)；注射14 d Tan ⅡA低、中剂量组HI、NA均较模型组降低，高剂量组较模型组升高(P<0.05)。与注射3 d相比，各组HI、NA增加，与注射7 d相比，Tan ⅡA低、中剂量组注射14 d时NA降低(P<0.05)。见表3。

表3 创面组织HI、NA比较

对照组切口组织无炎性细胞浸润。注射3 d，模型组大鼠创面组织存在明显水肿和大量炎性细胞浸润，无增生成纤维细胞；Tan ⅡA低、中剂量组创面组织周围有较多坏死组织、较少成纤维细胞增生并伴轻微水肿，存在大量炎性细胞浸润；Tan ⅡA高剂量组坏死组织较少，创面组织存在增生的成纤维细胞和大量炎性细胞浸润。注射7 d，模型组有少量炎性细胞浸润，间质胶原纤维增生并伴区域变性；Tan ⅡA低、中剂量组出现粗大的新生胶原纤维，其分布均匀但排列紊乱；Tan ⅡA高剂量组存在大量增生成纤维细胞，少量炎性细胞浸润，存在间质胶原纤维增生。注射14 d，模型组大鼠可见排列紊乱的成纤维细胞，胶原纤维无明显增生；Tan ⅡA低、中剂量组成纤维细胞减少、体积偏小，间质存在少量排列无序的胶原纤维；Tan ⅡA高剂量组新生表皮角质化明显，存在大量成纤维细胞、少量炎性细胞浸润。见图1。

注：A.对照组；B.模型组；C.Tan ⅡA低剂量组；D.Tan ⅡA中剂量组；E.Tan ⅡA高剂量组。

3.3 创面组织TGF-β1、TNF-α水平比较

注射3、7、14 d TanⅡA不同剂量组TGF-β1的水平均较模型组升高，TNF-α的水平较模型组降低(P<0.05)；Tan ⅡA剂量越高，TGF-β1水平越高，TNF-α水平越低(P<0.05)；Tan ⅡA不同剂量组TGF-β1、TNF-α水平随TanⅡ A注射时间的延长而降低(P<0.05)。见表4。

表4 创面组织TGF-β1、TNF-α水平比较

3.4 创面组织IL-10、GM-CSF mRNA表达水平比较

注射3、7、14 d Tan ⅡA不同剂量组的IL-10、GM-CSF mRNA表达水平均较模型组上升(P<0.05)；Tan ⅡA的剂量越大，IL-10、GM-CSF mRNA的水平越高(P<0.05)；Tan ⅡA不同剂量组GM-CSF mRNA的水平随Tan ⅡA注射时间的延长而降低，IL-10 mRNA的水平随注射时间的延长而升高(P<0.05)。见表5。

表5 创面组织IL-10、GM-CSF mRNA表达水平比较

3.5 创面组织IL-10、GM-CSF蛋白表达水平比较

注射3、7、14 d Tan ⅡA不同剂量组IL-10、GM-CSF蛋白的表达水平较模型组升高(P<0.05)；TanⅡA的剂量越大，IL-10、GM-CSF蛋白的表达水平越高(P<0.05)；TanⅡA不同剂量组GM-CSF蛋白的表达水平随TanⅡA注射时间的延长而降低，IL-10蛋白的表达水平随注射时间的延长而升高(P<0.05)。见表6、图2。

表6 创面组织IL-10、GM-CSF蛋白水平比较

注：A.对照组；B.模型组；C.Tan ⅡA低剂量组；D.Tan ⅡA中剂量组；E.Tan ⅡA高剂量组。

4 讨论

创面愈合是一个复杂的过程，包括止血、炎症、增殖和重塑等阶段[6]。增生性瘢痕是在某些异常因素的调控下，创面成纤维细胞过度增殖，胶原合成与分解的平衡被打破，细胞外基质大量无序沉积于组织中形成。我国传统中药在治疗瘢痕方面有着悠久的历史[7]。中药的传统功效是药效的理论依据，丹参具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痈等功效，可用于治疗胸痹心痛、癥痕积聚、疮疡肿痛等症[8]。现代药理研究表明，丹参具有保护血管内皮细胞、抑制胶原纤维产生和促进纤维蛋白降解及抗炎、抗氧化等作用[9-10]。Tan ⅡA是丹参的重要活性成分，在对抗纤维化疾病和炎症疾病中具有潜在的应用前景，有望成为治疗增生性瘢痕的药物。

本研究结果显示，Tan ⅡA各剂量组大鼠创面愈合时间短于模型组，愈合面积大于模型组，表明Tan ⅡA可加快创面愈合，抑制创面增生性瘢痕的形成。Tan ⅡA各剂量组的HI、NA均较模型组显著增加，表明Tan ⅡA促进创面修复前中期成纤维细胞增殖以促进创面修复。HE染色结果显示，注射3 d模型组大鼠创面组织存在明显水肿和大量炎性细胞浸润，无增生成纤维细胞；Tan ⅡA低、中剂量组有较少成纤维细胞增生；Tan ⅡA高剂量组存在大量增生成纤维细胞。注射7 d，Tan ⅡA高剂量组有大量增生成纤维细胞，存在间质胶原纤维增生。注射14 d，Tan ⅡA高剂量组新生表皮角质化明显，存在大量成纤维细胞，表明Tan ⅡA可以通过成纤维细胞大量增生来促进创面组织更好、更快地愈合。由此推测，Tan ⅡA使得创面修复过程中成纤维细胞增生、减少炎性细胞浸润、缩短创面愈合时间，并缩小愈合创面瘢痕面积，促进创面修复。既往研究显示，Tan ⅡA可通过减轻炎症反应，进而降低血脂和氧化应激反应，改善非酒精性脂肪肝[11]。也有研究证实，Tan ⅡA在皮肤痤疮中具有抗炎作用[12]。本研究在大鼠创面中也观察到相似的结果，表明Tan ⅡA可能通过发挥抗炎作用进而促进创面愈合。

炎症细胞可以通过分泌生长因子和细胞因子参与创面愈合。GM-CSF是一种多功能生长因子，皮肤受到创伤时其会参与到创面愈合的多个阶段[13-15]。GM-CSF可调控促进生长因子，如TGF等的生成，提高成纤维细胞增殖活性[16]。TGF-β1介导了多种组织纤维化反应，通过刺激间质细胞增殖产生细胞外基质[17]，促进皮肤伤口张力增加和创面局部纤维化，加速皮肤创伤愈合[18]。IL-10是减轻创面纤维化的重要因子[19]，可促进巨噬细胞抗炎因子的合成和释放，抑制单核或巨噬细胞抗原、TNF-α受体的表达[20]。TNF-α通过提高中性粒细胞的吞噬功能而具有促进炎症细胞分化的作用[21]。在本研究中，注射3、7、14 d TanⅡA各剂量组TGF-β1、TNF-α的水平均较模型组显著降低，IL-10、GM-CSF mRNA和蛋白的表达水平显著增加，表明Tan ⅡA可能是通过减轻炎性反应、增加IL-10和GM-CSF mRNA和蛋白的表达来抑制大鼠创面增生性瘢痕的产生、促进皮肤创伤愈合的。

综上所述，Tan ⅡA通过促进创面修复过程中成纤维细胞增生、减轻炎性反应，使大鼠创面瘢痕更快、更好地愈合，减少创面愈合后瘢痕的产生，可能是通过调节IL-10和GM-CSF mRNA和蛋白的表达发挥作用，为临床治疗创面愈合提供理论依据。