莲芝消炎片HPLC指纹图谱的建立及2种主要成分的测定

臧晴晴，刘飞飞，宏 伟，高 燕

1.淮南市食品药品检验中心，淮南 232000；2. 山东泰和医药科技有限公司，济南 250000

莲芝消炎片由穿心莲干浸膏和山芝麻干浸膏制成[1-3]，具有清热解毒、凉血消肿等功效，临床常用于治疗肺胃有热、火毒内盛引起的咳嗽气喘、扁桃体炎、喉痹咽痛等。莲芝消炎片现收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第二十册，现行标准中暂时只规定了性状、化学反应和薄层鉴别项目，暂无含量测定等指标，尚不足以全面控制其质量[4-5]。为了更加全面地评价莲芝消炎片的质量，提高其质量标准，本实验对莲芝消炎片进行了HPLC指纹图谱研究[6-15]，建立了莲芝消炎片的HPLC特征指纹图谱鉴别方法，并对其2种主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯进行了含量测定[16-22]，为莲芝消炎片的质量控制和进一步研究提供了参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260液相色谱仪；Waters 2489液相色谱仪；岛津LC-20AD液相色谱仪；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，SQP)；优普系列超纯水机(型号：UPT-II-10T，成都超纯科技有限公司)；超声波清洗器(ELMA S120H)。

1.2 试药

穿心莲内酯对照品(批号110797-202010，质量分数99.6%)，脱水穿心莲内酯对照品(批号110854-201710，质量分数99.6%)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈[色谱纯，批号19125211，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]、甲醇(分析纯，批号20210107，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 样品来源

不同来源的22批莲芝消炎片批号及来源见表1。

表1 22批莲芝消炎片样品批号及来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Chromcore C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；检测波长为225 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；流动相A(乙腈)，B(水)，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱比例

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取穿心莲内酯对照品适量，加甲醇制成1.0 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取样品粉末0.25 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，精密称定，超声处理30 min，称定质量，用甲醇补足减失质量，滤过，取续滤液，即得。

2.3 检测波长的选择

为全面考察样品中的成分，首先采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行紫外全波长扫描，发现在200～280 nm之间色谱峰较多，且吸收较好。进一步考察发现，在225 nm检测波长处，样品出峰数量较多，峰形较好且基线平稳。因此，选用225 nm作为莲芝消炎片HPLC指纹图谱的检测波长。莲芝消炎片紫外全波长扫描3D色谱图见图1。

图1 莲芝消炎片紫外全波长扫描3D色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1精密度实验 取18号样品(批号611073)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，连续进样6次，记录色谱图。以1号峰(穿心莲内酯)为参照峰S，考察各共有峰的相对保留时间及峰面积。结果显示各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.03%，峰面积RSD均小于0.02%，对指纹图谱进行相似度评价，其相似度均为1，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性实验 取18号样品(批号611073)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进行检测，记录色谱图。以1号峰(穿心莲内酯)为参照峰S，考察各共有峰的相对保留时间及峰面积。结果显示各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.03%，峰面积RSD均小于0.02%，对指纹图谱进行相似度评价，其相似度均为1，表明方法重复性良好。

2.4.3稳定性实验 取18号样品(批号611073)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、18、24 h进行测定，记录色谱图。以1号峰(穿心莲内酯)为参照峰S，考察各共有峰的相对保留时间及峰面积。结果显示各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.06%，峰面积RSD均小于0.05%，对指纹图谱进行相似度评价，其相似度均为1，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4耐用性实验 取18号样品(批号：611073)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别在不同品牌不同型号的液相色谱仪及色谱柱上进行测定，记录色谱图。结果显示同一台仪器不同的液相色谱柱(Agilent 1260，Chromcore C18、Diamonsil Plus C18、Ultimate XB-C18)或相同色谱柱不同的仪器(Chromcore C18，Agilent 1260、Waters 2489、岛津LC-20AD)，供试品峰形和分离度均良好，表明此方法耐用性较好。

2.5 供试品HPLC指纹图谱的测定

2.5.1共有峰确定 取22批莲芝消炎片按2.2项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，记录所有色谱图。结果显示6个共有峰的保留时间RSD均小于0.20%。以穿心莲内酯作为参照峰S，计算6个特征峰的相对保留时间，根据数据结果制定以下技术参数：峰1(1.00±10%)、峰2(1.07±10%)、峰3(1.13±10%)、峰4(1.52±10%)、峰5(1.68±10%)、峰6(1.74±10%)。见图2、表3。

图2 穿心莲内酯对照品色谱峰

2.5.2相似度评价 以22批样品的共有模式图谱作为参照图谱，在中药色谱指纹图谱相似度评价系统中(2004A版本)进行相似度评价，HPLC指纹图谱见图3，相似度结果见表4。

2.6 2种主要成分含量测定

2.6.1对照品溶液的确定 根据各样品的特征图谱，发现在22 批样品中，峰1(穿心莲内酯)和峰6(脱水穿心莲内酯)的峰高较高且峰面积较大，在莲芝消炎片的总化学成分中占比较大。因此，测定峰1和峰6的含量对控制其整体质量具有重要意义。通过对照品比对和液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)检测分析，确定了峰1为穿心莲内酯，峰6为脱水穿心莲内酯。

表3 22批样品共有峰的相对保留时间

图3 22批莲芝消炎片的共有模式及HPLC指纹图谱

表4 22批莲芝消炎片的相似度结果

2.6.2溶液的配制 分别取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯适量，加甲醇制成1.0 mg·mL-1的溶液，即得对照品溶液。取样品粉末0.25 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.6.3线性关系与范围 取穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液，逐级稀释成不同质量浓度的溶液，按2.1项下色谱条件进样检测，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，进行回归，结果显示线性关系良好，见表5。

表5 穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯线性关系与范围

2.6.4系统适用性实验 取18号样品(批号611073)，按2.6.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，连续进样6次，测得穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰的保留时间RSD分别为0.02%、0.02%，峰面积RSD分别为0.47%、0.47%，表明仪器适用性良好。

2.6.5重复性实验 取18号样品(批号611073)，按2.6.2项下方法制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进行检测，外标法计算6份样品的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量RSD分别为1.48%、1.51%，表明方法重复性良好。

2.6.6稳定性实验 取18号样品(批号611073)，按2.6.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、18、24 h进行测定，测得穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰的保留时间RSD分别为0.03 %、0.03%，峰面积RSD分别为1.53%、1.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.7加样回收率实验 精密称取18号样品(批号611073)，按2.6.2项下方法制备供试品溶液6份，分别精密加入含穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样检测，外标法计算含量和加样回收率。结果见表6。

表6 样品加样回收率实验结果 (n=6)

2.6.822批样品含量测定 取22批样品精密称定，按2.6.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，用外标法计算含量，结果见表7。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

通过采用DAD检测器对供试品溶液进行紫外全波长扫描，发现样品溶液在200～280 nm之间色谱峰较多，且吸收较好。进一步考察发现，在225 nm波长处，基本能反映出莲芝消炎片主要成分的整体情况。因此，选用225 nm作为莲芝消炎片HPLC指纹图谱的检测波长。

3.2 流动相的考察

本实验共考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液4种流动相体系，分别进行不同梯度的摸索。结果显示以乙腈-水作为流动相梯度洗脱时，样品出峰较好，基线较稳定且分离度良好。进一步考察，确定了2.1项下的流动相体系。

3.3 色谱柱及柱温的考察

本实验选用Agilent 1260高效液相色谱仪，分别考察了Chromcore C18、Diamonsil Plus C18、Ultimate XB-C183种色谱柱的分离效果，结果显示，各色谱柱之间分离效果相差不大，证明本方法耐用性良好。同时，对不同的柱温(25、30、35、40 ℃)进行考察，结果显示30 ℃分离效果较好。

3.4 相似度及含量测定评价

本研究对22批不同来源的莲芝消炎片进行了相似度分析，结果显示，不同来源的样品之间所含成分基本一致。其中13号、14号样品相似度较低，其他20批样品相似度均在0.90以上。在含量测定结果中，13、14、15号穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量相较于其他样品也相对偏低，这可能是由于不同厂家对原药材的采集加工与炮制不同所致，生产制备工艺过程也可能对含量有影响。同时穿心莲成分在高温下易分解也对药品质量存在一定程度的影响。相同厂家不同批次或同一厂家相同批次间相似度和含量略有差别，不同厂家间主成分含量部分批次差别较大，详见表7。另外，指纹图谱结果发现，18～22号样品有7个共有峰，其他样品则有6个共有峰，这可能与不同的制备工艺导致药物成分损失有关，尚需进一步研究。

4 结论

本研究建立了莲芝消炎片的HPLC指纹图谱并对其2种主要成分进行了含量测定，所建立指纹图谱方法具有简便、准确、重复性好等特点，完善了莲芝消炎片的质量标准，为进一步的研究提供了科学依据。