包穗突变体sui1-5鉴定及OsPSS1互作蛋白筛选

杨 晔 孙 琦 邢欣欣 张海涛,* 赵志超,* 程治军

包穗突变体鉴定及OsPSS1互作蛋白筛选

杨 晔1孙 琦2邢欣欣2张海涛1,*赵志超2,*程治军2

1安徽农业大学农学院, 安徽合肥 230036;2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081

包穗是水稻生产上的不利性状, 表现为倒一节间伸长异常, 穗部不能正常从叶鞘伸出。目前, 已经鉴定报道了多个包穗性状突变体, 但对该性状产生的分子机制认识仍然有限。是一个磷脂酰丝氨酸合酶的编码基因, 该基因突变会引起突变体的倒一节间严重缩短。我们鉴定到了一个新的等位突变体, 该突变体倒一节间缩短程度明显减轻。测序发现突变体中基因的第7个外显子存在1个单碱基G→T替换, 导致甘氨酸突变为缬氨酸。为了研究的功能, 我们通过酵母筛库发现了一个与OsPSS1互作的蛋白GH9A3, 并通过酵母双杂交、荧光素酶互补(LCI)和双分子荧光互补(BIFC)实验加以验证。是基因家族成员, 编码内切-1,4-β葡聚糖酶, 推测是细胞壁成分纤维素合成的一个关键酶。在苗期,和互作蛋白编码基因的表达量并不同步,在的表达量上调。但是在拔节抽穗期,和在中的表达量都相应降低, 其他纤维素合酶家族基因的表达量在中也明显降低。这些结果为进一步研究的功能奠定了一定的理论基础。

包穗;;; 精细定位; 纤维素合酶

水稻包穗现象是由于植株倒一节间(穗颈节)缩短或不伸长造成的。在杂交稻的制种过程中, 由于不育系有包穗现象, 稻穗不能充分从叶鞘的包裹中伸出, 导致包裹在叶鞘部分的小穗败育, 影响了不育系的制种产量[1]。作为补救措施, 生产上通常采用喷施赤霉素等方法解除包穗现象来提高制种产量, 这样不仅增加制种成本, 还会因为赤霉素降低种子休眠而造成田间穗发芽, 降低制种质量[2-3]。因此, 通过研究水稻穗颈节间伸长的分子机制及其调控网络, 旨在从分子设计育种的角度去除这种现象。

目前已经报道了12个控制水稻倒一节间伸长的QTL[4]。发现并鉴定了多个穗颈节相关突变体, 大部分的穗颈节突变体为包穗突变体。根据倒一节间的长度变化, 可以将这些突变体分为穗颈节伸长突变体(和)[5-6], 部分包穗突变体(、、、、、、、、、)和全包穗突变体(、、、、)[7-20]。半包穗突变体一般表现为穗颈节缩短, 穗型短小等特征, 其中[7]、[9]、[10]和[14]为显性包穗突变体, 突变基因分别定位在1、5、3和2号染色体上, 隐性包穗突变体[11]和[12]的突变基因分别定位在4号和2号染色体上。全包穗突变体、和特定倒一节间极端缩短,[19]和[20]突变体虽然也是全包穗, 但各节间均不同程度缩短。此外, 对油菜素内酯途径基因的研究发现, 该基因的过表达也能导致包穗现象[14]; 基因的表达量下调, 抽穗期倒一节间ABA/GA平衡发生变化, ABA含量增加, GAs合成受到抑制, 也会导致包穗[15]。在基因克隆方面, 调控穗颈节伸长的基因催化非13-羟基化GAs的16α,17-环氧化, 降低了水稻GA4的活性, 突变体穗颈节积累了大量GA, 导致伸长生长失控[21]。3个包穗突变体s、esp2和是编码磷脂酰丝氨酸合酶的基因的等位突变体[13,17,22]。我们在对突变体的研究时发现, 突变体的磷脂酰丝氨酸含量下降, 它的前体磷脂酰乙醇胺的含量升高, 与主导磷脂酰丝氨酸的合成功能一致。同时, 也发现了OsPSS1参与了细胞内从后高尔基体到质膜外的囊泡运输的证据, 在突变体中, 纤维素合酶复合体成分OsCesA4的向膜运输出现障碍, 纤维素和果胶质等细胞壁成分的合成受阻, 含量减少, 细胞壁的结构出现了异常[22]。

截至目前, OsPSS1和纤维素酶复合体成分OsCesA4的运输到底有什么关系还不得而知。本研究报道通过酵母筛库的方法, 筛选到了一个OsPSS1的互作蛋白GH9A3, 同时由于表型过于矮化, 不利于构建双突变体用于后续的遗传研究, 我们还发掘并验证了一个的弱等位突变体, 为后续的基因功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻包穗突变体来源于粳稻品种Kitaake组织培养后代。以粳稻品种IRAT129作为母本, 突变体为父本进行杂交获得F1代, 经海南加代后F2定位群体种植于中国农业科学院作物科学研究所顺义基地。成熟期, 随机取野生型和各10株, 统计株高、分蘖数、各节间长度、穗长、每穗粒数、粒宽、粒长、粒厚、千粒重和结实率等农艺性状, 进行后续数据分析。

1.2 倒二节间细胞学观察

抽穗期取野生型与突变体茎秆倒二节间, 用刀片切取3 mm左右节间组织, 放入戊二醛固定液中, 抽真空、漂洗、脱水、渗透和包埋, 最后制成半薄切片并染色。在光学显微镜下观察并照相。

1.3 包穗突变基因的精细定位及其候选基因的分析

取F2分离群体中514株隐性(包穗表型)单株及2个亲本和IRAT129的叶片, 采用CTAB法提取叶片全基因组DNA。随机选取20株隐性单株, 分为2组构建混池。利用均匀分布在12条染色体上的192对亲本多态性引物进行基因连锁分析, 再用66个隐性单株进行初定位。利用gramene网站(https:// www.gramene.org/)寻找日本晴和籼稻9311间SNP/InDel位点, 用Primier 3.0 (https://bioinfo.ut.ee/ primer3/)网站设计精细定位用引物, 由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。PCR扩增体系为10mL: Premix5mL、模板DNA 1mL、正反向引物各1mL (浓度10 µmolL–1)、ddH2O 2mL。反应程序为: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 33个循环; 72℃终延伸5 min。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染显色后观察统计。利用水稻基因组注释网站(http://rice.uga.edu/cgi-bin/ gbrowse/rice/) 确定区间内ORF。

表1 用于基因精细定位的Indel和SNP引物

1.4 互作蛋白筛选

1.4.1 酵母筛库 将基因CDS序列连接至pGBKT7(BD)载体做为诱饵蛋白, 验证有无自激活。pGADT7(AD)上构建的水稻cDNA菌液文库作为目的蛋白。将pGBKT7-SUI1融合质粒转入酵母感受态AH109培养。收集菌体, 用4mL一缺(-Trp)液体培养基重悬菌体并和菌液文库、液体YPDA(K+)培养基加入2L锥形瓶中, 30℃摇床30～50转 min–1慢摇20～24h。最后1000×离心10min收集菌体, 用10mL0.5× YPDA(K+)重悬菌体, 涂四缺(SD-Leu/-Trp/- His/-Ade)平板400mL×25个。30℃培养3～5 d后, 挑取单克隆破壁, 用pGADT7两侧引物扩增目的基因cDNA片段, 送测, 通过Blast查找目的基因进行后续蛋白互作验证。

1.4.2 互作蛋白验证 酵母双杂交:与目的基因CDS序列分别连接pGADT7和pGBKT7载体共转化, 设置阴性对照和实验组, 在酵母二缺培养基(SD-Leu/-Trp)上培养3～5 d。挑取单克隆, 设置5个浓度梯度分别涂至二缺(SD-Leu/-Trp)和四缺(SD- Leu/-Trp/-His/-Ade)酵母培养基, 3～5 d后照相记录结果。LCI实验: 构建nLUC-SUI1和cLUC-GH9A3质粒载体并转入农杆菌, 根据实验需要配置对照组和实验组, 用不加针头的注射器将农杆菌侵染液注射进6～8周大的本氏烟草叶片中。48 h后在植物活体成像仪中观察, 分析烟草叶片的LUC活性。BIFC实验: 构建p2YC-SUI1和片p2YN-GH9A3质粒载体转农杆菌, 配置实验组和对照组侵染液, 注射烟草叶片。2 d后在共聚焦显微镜(ZEISS Microsystems LSM 700)观察荧光。

1.5 亚细胞定位

扩增基因CDS序列(去除终止密码子)连接至35S::GFP载体, 构建35S::GH9A3-GFP融合表达载体, 将35S::GH9A3-GFP和膜marker (mCherry)共转化, 侵染烟草叶肉表皮细胞, 设置空对照。48 h后用激光共聚焦显微镜观察荧光。

1.6 RNA的提取和qRT-PCR基因表达量分析

取野生型Kitaake和苗期幼茎和抽穗期倒二节间组织, 利用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒(TIANGEN公司, 北京), 提取总RNA并反转录获得cDNA。利用、和相关基因的CDS序列在线设计荧光定量引物(表2)。用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)配制反应体系, 在定量仪器(Applied Biosystems 7500 Real-time PCR)上进行扩增, 每个样品3个重复。

表2 用于qRT-PCR引物

2 结果与分析

2.1 包穗突变体sui1-5表型鉴定

本实验室之前报道了一个等位突变体(图1-A),由于苗期就表现矮化, 不利于后续的基因功能研究。之后, 我们又鉴定到一个的弱突变体。在营养生长阶段, 野生型和突变体的株高差异不显著, 生殖生长阶段开始, 由于突变体倒一节间伸长受阻,株高降低(图1-B～D), 同时伴随着分蘖数增加、穗长缩短、每穗粒数减少、结实率降低和剑叶变窄等表型(表3)。对倒二节间茎秆细胞学观察发现, 节间缩短主要由于细胞伸长生长不足导致(图1-E～K)。

图1 野生型和突变体表型对比

A: 野生型Kitaake (左)与突变体(右)抽穗期表型对比; B: 野生型Kitaake (左)与突变体(右)抽穗期表型对比; C: 野生型(左)和突变体(右)穗部表型以及各节间长度对比; D: 野生型与突变体各节间长度对株高的贡献率; E, F: 野生型(E)和突变体(F)倒二节间纵切面细胞学比较; G, H: 野生型和突变体纵切薄壁细胞长度和宽度; I, J: 野生型(I)和突变体(J)倒二节间横切面细胞学比较; K: 野生型和突变体倒二节间横截面半径细胞数目。标尺: (A) 10 cm, (B) 10 cm, (C) 10 cm, (E, F) 100μm, (I, J) 100μm。*表示在< 0.05水平差异显著。

A: phenotypes of Kitaake (left) and(right) plants atheadingstage; B: phenotypes of Kitaake (left) and(right) plants atheadingstage; C: phenotype comparison of the sheathed panicleandtheinternodelengthofWT (left) and(right) at headingstag; D: contribution rate of internode length to plant height of wild type and mutant; E, F: longitudinal sections of the second internode of wild type (E) and(F); G, H: comparisons of the length and width of stem parenchyma cells from longitudinal sections of the second internode in wild type and; I, J: transverse sections of the secondinternode of wild type (I) and(J);K: the comparison of cell numbers of the radius in the transverse sections of the second internode in wild type and. Bar: (A)10 cm, (B) 10 cm, (C) 10 cm, (E, F)100 µm, (I, J)100µm. * represents significantly different at< 0.05.

表3 野生型和突变体农艺性状比较

*表示在< 0.05水平差异显著;**表示在< 0.01水平差异显著。

*represents significantly different at< 0.05;**represents significantly different at< 0.01.

2.2 包穗突变体sui1-5的遗传分析及基因定位

与品种IRAT129杂交的F1代植株倒一节间正常伸长, F2代出现正常表型和包穗表型分离, 随机对F2代267株单株考察发现, 正常株为204株, 包穗株为63株, 经卡方(χ2)检测(χ2=0.87, χ20.05=3.84),符合3∶1分离定律。从F2代定位群体中选取隐性单株构建混池, 利用遍布12条染色体上的192对多态引物, 对DNA混池进行连锁分析, 初步将该基因连锁到标记Inc1-1附近, 随后选用66个单株进行连锁标记验证, 并将候选基因初步定位在标记Inc-1至Y1-7之间约1 Mb的区间内。利用粳稻和籼稻之间的多态性重新设计引物, 用514株隐性单株将候选基因精细定位在标记Y1-3至Y1-4之间的38.05 kb区间内(图2)。

2.3 候选基因分析

根据基因组注释网站(http://rice.uga.edu/cgi-bin/ gbrowse/rice/), 该定位区间内包含3个候选基因, 测序分析发现, 仅有ORF1 ()的第7个外显子存在单碱基G→T的替换, 导致第185位氨基酸从甘氨酸突变为缬氨酸。ORF1编码一个磷脂酰丝氨酸合酶, 是已经被克隆的基因[13,22]。结合包穗以及倒一节间缩短的表型, 我们推定ORF1即为调控该包穗表型的候选基因。

(图2)

A:初步定位在1号染色体标记Y1-1与Y1-7之间; B:精细定位在标记Y1-3和Y1-4之间38.05 kb范围内; 横线上方为基因定位所用分子标记, 横线下方为交换单株数。C:精细定位区间内包含3个候选基因; D:基因包含12个外显子和11个内含子, 白方块表示编码区, 黑方块表示非编码区, 线条表示内含子下图为Kitaake和在第7个外显子上的序列对比, 箭头指向突变的碱基。

A: the primary mapping ofbetween markers Y1-1 and Y1-7 on the 1st chromosome; B:was fine mapped to the interval between the markers Y1-3 and Y1-4, a 38.05 kb region. Above the line is the molecular marker used for genemapping, and below the line is the recombinants identified by the corresponding markers. C: 3 ORFs within the fine-mapped region; D: thegene contains 12 exons and 11 introns. The white block represents the coding region and the black block represents the non-coding region. The line represents the sequence comparison of Kitaake andin the seventh exon, and the arrow points to the mutant base.

2.4 OsPSS1互作蛋白筛选与验证

参与了细胞内囊泡从后高尔基体到质膜的胞吐过程, 该基因的突变导致纤维素合酶复合体成分OsCesA4的向膜外运输出现障碍[22]。OsCesA4作为纤维素酶复合体的成员, 曾被认为是囊泡的重要内含物[23]。为了理解OsPSS1参与这种囊泡运输的分子机理, 我们利用酵母筛库, 最终得到了68个候选的互作蛋白, 其中有一个纤维素酶GH9A3。随后, 酵母双杂交验证(图3-A)、在幼嫩烟草叶片荧光素酶互补(图3-B)和双分子荧光互补(图3-C)实验都支持它们的互作。

是已知类型最广泛的纤维素酶之一, 拟南芥全基因组测序分析发现了25个家族基因, 水稻中至少有20个基因[24]。GH9家族蛋白由α、β和γ三个亚家族组成, GH9B和GH9C为α、β亚族, GH9A为γ亚族[25-26]。水稻和拟南芥中各有3个GH9A蛋白, GH9A亚族蛋白包含一个富含脯氨酸的C端和具有跨膜结构域的N端, 它是GH9家族蛋白中唯一的膜锚定内切-β-1,4-葡聚糖酶(EGases, EC3.2.1.4)[24-28]。家族基因参与了纤维素的生物合成、细胞壁组装和节间伸长[29-30]。对OsGH9A蛋白进化树分析发现, 水稻和拟南芥GH9A亚族蛋白之间有很高的同源性(图4)。OsGH9A3与水稻OsGH9A1、OSGH9A2的蛋白同源性分别为76.8%和62.0%, 与拟南芥中AtGH9A1/KOR1蛋白同源性为72.1%。基因()的突变导致植株纤维素含量减少, 果胶增加, 影响了水稻各节间的伸长[30]。()参与水稻根系纤维素的合成,是水稻根细胞伸长和分裂所必需的[31]。()参与拟南芥初级细胞壁形成过程中的纤维素沉积, 与纤维素合酶高度共表达[32]。是初级细胞壁纤维素合酶复合体CSCs (cellulose synthase complex)不可或缺的组分[33]。水稻中有2个转录本, 但是它们的分子机制和生物学功能至今未有报道。

图3 SUI1与GH9A3蛋白互作验证

A: 酵母双杂交验证SUI1和GH9A3的互作。AD: 转录激活域; BD: DNA结合结构域; SD: 营养缺陷型培养基。B: 荧光素酶互补成像(LCI)验证SUI1与GH9A3在本氏烟草中的互作。C: BiFC在本氏烟草中验证SUI1与GH9A3的互作, mCherry: SCAMP1。至少重复3个独立烟草叶片。

A: the interaction between SUI1 and GH9A3 in a yeast two-hybrid system. AD: activation domain; BD: DNA binding domain; SD: nutrient deficient medium. B: LCI assay indicates that SUI1 interacts with GH9A3 inleaves. C: the interaction validation between SUI1 and GH9A3 by BiFC assay in, mCherry: SCAMP1. At least three independentleaves was repeated.

图4 水稻GH9A3蛋白进化树分析

水稻OsGH9A3蛋白序列作为Qurry序列, 普通小麦、玉米和拟南芥作为候选物种, 以BLAST得到的同源蛋白在MEGA7.0中采用邻接法构建进化树。引导程序值以节点上的百分比显示。分支长度与用于推断系统发育树的进化距离。结果表明OsGH9A3与玉米gpm617蛋白同源性最接近, 水稻和拟南芥GH9A家族蛋白之间同源性也比较高。

The OsGH9A3 protein sequence was used as a Qurry sequence, the candidate species including,, and, and the homologous protein obtained by blast were constructed the evolutionary tree with Neighbor-Joining method in MEGA 7.0. The boot program value is shown as a percentage on the node. The branch length is used to infer the evolutionary distance of phylogenetic trees. OsGH9A3 had the closest homology with gpm617 protein in, and the homology between rice andGH9A family proteins was also relatively high.

2.5 SUI1与GH9A3在烟草表皮的亚细胞定位

SUI1与Golgi、TGN和PM共定位, 参与了胞吐过程[22]。由于GH9A3和SUI1一样存在跨膜结构域, 为了解SUI1与GH9A3的定位关系, 我们构建了35s::GH9A3-GFP载体, 初步发现GH9A3除定位在烟草表皮细胞的质膜上外, 还发现在表达35s::GH9A3-GFP载体的烟草细胞中带有一些点状GFP荧光信号, 预示着GH9A3也有可能和SUI1一起参与了Golgi-TGN-PM的分泌途径(图5)。

2.6 抽穗期突变体sui1-5的SUI1和GH9A3基因表达量显著降低

尽管突变体和野生型在成熟时株高差异明显, 但是在幼苗期的苗高和根略长于野生型(图6-A)。我们分析了幼苗期和抽穗期基因和在野生型和突变体中的相对表达量, 发现苗期基因在突变体中的表达量与野生型差异不大, 但是基因在突变体里表达量更高, 说明2个基因的表达量并不同步。抽穗时,与在突变体的表达量都显著降低, 相对于基因表达量80%以上的降幅来说,的降幅仅有50%左右(图6-B)。之前的研究表明, 基因在幼嫩的伸长组织中表达量最高,与在抽穗时的表达量同步降低的结果表明,也是节间伸长所必须的。

图5 GH9A3烟草表皮亚细胞定位

上图为35S-GFP空载体对照; 下图为连接GH9A3片段的35S-GFP载体, mCherry: AtSYP122, GH9A3定位在烟草表皮细胞的质膜上, 伴随点状结构。

The above figure shows the control of 35S-GFP empty carrier. The following figure shows the 35S-GFP vector connecting GH9A3 fragment. mCherry: AtSYP122, GH9A3 is located on the plasma membrane of tobacco epidermal cells with dot structure.

图6 SUI1与GH9A3表达量在抽穗期的突变体中显著降低

A: 幼苗期野生型和突变体表型, 左: 野生型, 右: 突变体; B: 基因和在苗期(左)和抽穗期(右)表达量的变化情况。在突变体中2个基因在抽穗期的表达量均大幅下降。**表示在< 0.01水平差异显著。

A: seedling phenotype of wild type and mutant,left: wild type, right:; B: the expression changes ofandinat seeding stage (left) and heading stage (right). The relative expression levels of two genes in the mutant were decreased significantly at heading stage. **:< 0.01.

2.7 GH9A3与CESAs家族基因共同参与纤维素的合成

纤维素由定位在质膜上的纤维素合酶(CESA)复合体(CSCs)合成, CSCs在内质网或高尔基体中组装后被传递到质膜(PM)[34]。鉴于家族基因有可能参与纤维素的生物合成, 因此, 我们在野生型和突变体抽穗期的茎中对纤维素合成关键酶的表达量进行了分析, 结果表明在突变体中表达量均显著降低, 其中参与次级细胞壁纤维素合酶相关基因、和表达量相较于初级细胞壁纤维素合酶基因、和[35-36]下调更为显著(图7)。上述结果表明可能与和纤维素合酶家族的其他基因一起, 参与了茎细胞壁的合成。

图7 CESAs纤维素合酶家族基因表达量分析

的表达量在突变体抽穗期的茎中显著下调。、和参与初级细胞壁合成;、和参与次级细胞壁合成。**表示在< 0.01水平差异显著。

The relative expression level ofwas significantly down- regulated inculms at heading stage.,, andare involved in primary cell wall cellulose biosynthesis.,, andare responsible for cellulose biosynthesis in the secondary cell walls. **:< 0.01.

3 讨论

本实验室先前报道了一个包穗突变体。对新的包穗突变体的研究发现, 它是的等位突变, 突变造成第7个外显子1个单碱基G→T的替换, 导致氨基酸从甘氨酸突变为缬氨酸。比较2个突变体的突变位置, 我们发现的点突变造成了2个跨膜区丢失[22], 从而导致磷脂酰丝氨酸合酶结构不完整, 功能缺失, 而的点突变没有对跨膜区造成影响。是一个弱表型的突变体, 将为后续的功能研究提供很好的用于构建双突变体的材料。

细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等组成[37]。纤维素由定位在质膜上的纤维素合酶复合体CSCs合成, 其中、和已被鉴定参与初生胞壁的形成,、和形成一个纤维素合成复合体, 参与次生细胞壁的合成[35-36]。之前的研究发现, SUI1参与了细胞内物质的从Golgi体到TGN再到质膜的分泌途径。突变体倒一节间不伸长的原因, 是由于突变体中的OsCESA4等用于细胞壁合成的酶类运输受阻, 最终导致细胞壁物质合成能力下降[22]。在本研究中, 通过酵母筛库发现了一个SUI1互作蛋白GH9A3, 在拟南芥中GH9A3的同源蛋白KOR1 (AtGH9A1)是初级细胞壁CSCs不可或缺的组分, 与CSC部分共定位[33]。KOR1蛋白C端富含的脯氨酸基序是维持KOR1在TGN/PM中循环所必需[28]。KOR1与TGN的标记物SYP61广泛重叠[38]。在水稻中,的突变体表现为细胞伸长率降低, 节间伸长受阻[30]。GH9A3在质膜上的定位存在点状GFP荧光信号, 预示着GH9A3可能也是一个分泌到膜上的细胞壁合成的关键酶类。后续研究中我们将构建敲除、过表达转基因植株, 验证与细胞壁合成的关系, 同时构建双突变体确定和的遗传关系。

在拟南芥中, Gu等[39]通过酵母双杂交实验, 鉴定到了一个与CESA6互作的蛋白CSI1 (cellulose synthase interactive protein 1), 这个蛋白既和CESA1互作也和CESA3弱互作, 突变体表现为生长缺陷, 植株的纤维素含量降低, 从CSI1与CESA3在膜上的共定位结果, 作者推测CSI1可能作为CSC的组装平台, 将CSC靶向质膜或者在CSC与微管互作上发挥作用。Zhu等[40]进一步发现, CSC的向膜运输受CSI1、植物特异性蛋白PATROL1和胞外复合体蛋白的共同调控, 其中CSI1标出囊泡的结合部位, PATROL1参与与多种蛋白的互作, 协助囊泡的胞吐过程, PATROL1和胞吐复合体蛋白共同决定了运输CSC蛋白到细胞膜的速度。细胞壁前体物质和纤维素合酶复合体通过囊泡分泌参与细胞壁的形成过程, 其中纤维素合酶复合体通过囊泡运输到质膜上, 在水稻中,是一个分泌缺陷突变体, 磷脂酰丝氨酸合酶基因的突变导致质膜到细胞壁分泌过程缺陷, 纤维素合酶不能正常的与质膜融合, 因此在突变体中纤维素合酶相关基因表达下调, 纤维素合成减少[22]。SUI1可能是新的未被研究的参与CSC运输的蛋白, 至于它在CSC运输过程中所起的作用, 以及与已知的CSC运输协助蛋白的关系, 仍然需要进一步的研究。

4 结论

鉴于先前报道的表型过于极端, 不利于后续基因功能的研究, 本研究鉴定了一个新弱等位突变体。同时通过酵母筛库发现了一个SUI1互作蛋白, 经酵母双杂交、LCI、BIFC验证了SUI1与GH9A3互作。在中抽穗期的茎中,与纤维素合酶家族基因表达量均显著下调, 最终影响了倒一节间细胞壁成分的合成, 从而影响了倒一节间的伸长生长。

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Identification of sheathed panicle mutantandscreening of OsPSS1 interaction protein in rice (L.)

YANG Ye1, SUN Qi2, XING Xin-Xin2, ZHANG Hai-Tao1,*, ZHAO Zhi-Chao2,*, and CHENG Zhi-Jun2

1College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, Anhui, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

The sheathed panicle phenomenon is a disadvantageous trait in agricultural production, which is mainly due to the abnormal elongation of the uppermost internode, resulting in the panicle closed by flag leaf sheath. Although some mutants of sheathed panicle have been identified and reported in rice, the underling molecular mechanism of uppermost internode shortening is still poorly understood.is a phosphatidylserine synthase geneand the mutation ofleads to a severe shortening of the uppermost internode of mutant. We discovered and identified a new allelic mutantofandthe degree of the uppermost internode shortening inwas significantly reduced. Sequence analysis revealed a single nucleotide substitution of G to T at the seventh exon ofin,resulting in an amino acid change from glycine to valine. To study the function of, we detected a protein GH9A3 interacting with SUI1 through a yeast screening library, which was verified by yeast two-hybrid, luciferase complementarity (LCI), and bimolecular fluorescence complementarity (BiFC).was a member ofgene family, encoding an endo-β-1,4-glucanase which was speculated to be a key enzyme in cell wall cellulose synthesis. At seedling stage, the relative expression level ofwas not synchronized with that of interaction protein-coding gene, and therelative expression level ofwas up-regulated in. But at heading and jointing stage, the relative expression level ofanddecreased synchronously, and the relative expression level of other cellulose synthasefamily genes decreased obviously in. These results lay a foundation for further study of the function of

sheathed panicle;;; fine mapping; cellulose synthesis

10.3724/SP.J.1006.2023.22014

本研究由国家自然科学基金项目(31871603)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871603).

通信作者(Corresponding authors):张海涛, E-mail: 43647174@qq.com; 赵志超, E-mail: zhaozhichao@caas.cn

E-mail: 874498704@qq.com

2022-03-05;

2022-07-21;

(网络出版日期): 2022-08-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1303.004.html

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