绿萝组织培养和遗传转化条件优化

陆玉建，李雪晗，袁新惠，许悦，朱丽晖，田梦菲，田玉雪，邱欣欣

（1.滨州学院 生物与环境工程学院，山东 滨州 256603；2.山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603；3.山东省黄河三角洲生态脆弱带工程技术研究中心，山东 滨州 256603）

绿萝为天南星科绿萝属常绿观叶植物，具有较强的吸收甲醛的能力，主要通过扦插的方式进行繁殖[1-2]。绿萝扦插繁殖时生长速度慢，繁殖系数低，难以进行优良品种的选育。而植物组织培养技术则可弥补上述不足。为此，郭英等[3]以茎段为外植体进行组织培养，结果表明，愈伤组织诱导最适培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.4 mg/L 2，4-D，分化培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA。范俊岗[4]以绿萝叶片为外植体进行离体培养，结果显示，愈伤组织诱导最适培养基为MS+0.2 mg/L TDZ+ 0.5 mg/L NAA，不定芽诱导培养基为MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA和MS+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，生根诱导培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。陈广玉[5]研究发现，绿萝叶片愈伤组织诱导最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D，分化培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，生根培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA。现阶段，绿萝高效稳定的再生体系尚未建立，转基因方面的研究还较少。为提高外源基因的转化效率，有必要继续优化绿萝组织培养条件。

甲醛是一种易挥发，带有强烈刺激性气味的气体[6]。植物净化法去除甲醛，不仅具有简单、经济、科学的优点，又有美学价值与生态功能，已成为备受青睐的绿色修复技术[7]。高等植物去除甲醛与甲醛脱氢酶（FALDH）密切相关，在FALDH的参与下，甲醛方可进入植物组织并最终转化为CO2[8]。目前已经拟南芥、玉米、绿萝等多种植物中分离获得了FALDH[9-11]。拟南芥中AtFALDH过表达，拟南芥甲醛吸收能力明显增强[12]。将绿萝FALDH基因转入拟南芥，拟南芥甲醛吸收效率同样提高[11,13]。虽然绿萝吸收甲醛的能力较强，但仍有待于进一步提高，而通过基因工程技术提高绿萝吸收甲醛的能力无疑是一种非常有效的途径。目前，有关FALDH基因转化绿萝的研究尚未见相关报道，本试验在建立绿萝高频再生体系的基础上，将AtFALDH导入绿萝中，试图实现外源基因的高效表达，进而增强绿萝吸收甲醛的能力。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为小叶绿萝（Eipremnum aureum），大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101。

1.2 试验方法

1.2.1 绿萝离体再生 以绿萝叶片和叶柄为外植体，分别用70%酒精消毒30 s，用0.1%升汞处理15 min，无菌水冲洗5～6次。将外植体接入愈伤组织诱导培养基（表1，共9个处理），30 d后观察愈伤组织的诱导情况，统计叶片和叶柄愈伤组织诱导率。将叶片或叶柄诱导产生的愈伤组织接种入分化培养基（表2，共9个处理），30 d后观察不定芽的分化情况，统计愈伤组织不定芽诱导率。将不定芽插入生根培养基中（表3，共6个处理），30 d后统计不定芽的生根率。

1.2.2 目的基因的克隆和表达载体构建 拟南芥甲醛脱氢酶基因AtFALDH引物序列（下划线代表酶切位点的位置）如下，AtFALDHLP：5'-GGGGAG CTCATGGCGACTCAAGGTCAGGTTATCA-3'（SacⅠ），AtFALDHRP：5'-GGGTCTAGATTT GCTGGTATCGAGGACACAACG-3'（XbaⅠ）。提取拟南芥RNA，高保真PCR扩增AtFALDH基因。

将PCR扩增的AtFALDH基因插入pMD18-T载 体，用SacⅠ-XbaⅠ分 别 酶 切pMD18-TAtFALDH和p2300-gfp，将回收产物进行连接，从而构建p2300-AtFALDH-gfp表达载体。

1.2.3 绿萝遗传转化 培养含p2300-AtFALDHgfp表达载体的农杆菌，使其OD600值分别为0.2、0.5和1.0，离心后用MS培养基重悬浮，将绿萝叶柄愈伤组织置于菌液中侵染5、10 min或15 min，共培养1、2 d或3 d；然后转入含抗生素的培养基中进行筛选，诱导抗性芽。根据绿萝愈伤组织的分化率确定适宜的转化条件。切取抗性不定芽，诱导生根，进而获得转基因绿萝。

1.3 数据处理

利用Excel 2007进行数据统计，通过SPSS 17.0软件中单因素方差分析对数据之间的差异性进行比较。

2 结果与分析

2.1 绿萝再生体系优化

2.1.1 植物生长物质对外植体愈伤组织诱导的影响 统计分析结果表明（表1），绿萝叶片在AC3、AC4、AC6、AC8和AC9培养基中均可诱导产生愈伤组织，其愈伤组织诱导率介于9.1%～61.5%。其中，AC9的效果最好，叶片产生愈伤组织的量也较多，与其他培养基相比，愈伤组织诱导率差异显著。叶柄在9种愈伤组织诱导培养基中均可产生愈伤组织，其中效果最好的为AC4，愈伤组织的诱导率达到97.8%，不仅产生愈伤组织的量较多，而且生长比较旺盛；其次是AC3和AC9，愈伤组织的诱导率也在90%以上，这3种培养基中愈伤组织诱导率和其他大部分培养基相比，存在较显著的差异；再次为AC6，其愈伤组织的诱导率接近90%；其他几种培养基的诱导效果则稍差。

表1 绿萝叶片和叶柄愈伤组织诱导率变化Tab.1 Callus induction rate change of leaves and petioles of Eipremnum aureum

2.1.2 植物生长物质对绿萝不定芽诱导的影响 统计分析结果表明（表2），叶片诱导产生的愈伤组织只有在A4、A8、A9中方可诱导产生明显的不定芽，其中，A8中不定芽生长良好，分化率可以接近100%，和其他8种培养基中不定芽诱导率之间存在显著的差异；其次为A4和A9，分化率约为67%，其余培养基中无明显不定芽产生。叶柄诱导产生的愈伤组织在这9种培养基中都有不定芽的分化，其 中，A2、A3、A4、A6、A8、A9的 分 化 率 均 接 近100%，和其他3种培养基中不定芽诱导率之间存在显著的差异。其次为A5、A7，其芽的分化率也在50%～70%，芽分化明显，但分化率较低。较差的为A1，芽分化率30%左右。总体来说，A9的效果最佳，不仅不定芽分化率较高，而且不定芽数量较多，生长旺盛；叶柄愈伤组织诱导不定芽效果明显要优于叶片。

表2 绿萝叶片和叶柄愈伤组织分化率变化Tab.2 Callus differentiation rate change of leaves and petioles of Eipremnum aureum

2.1.3 植物生长物质对绿萝不定芽生根的影响 将叶片或叶柄诱导产生的不定芽切下，进行生根培养，30 d后统计不定芽的生根情况。结果表明，在6种培养基中均有根的生成，而且根的长势较好，生根率都为100%，其中R2生根效果最好，根粗壮，长度合适，须根数量适宜，利于移栽成活（表3）。

表3 绿萝不定芽生根率变化Tab.3 Rooting rate change of adventitious buds of Eipremnum aureum

2.2 绿萝的离体再生

将绿萝叶片接种到培养基AC9中，30 d后可诱导产生少量乳白色的愈伤组织（图1-A）。继代培养14 d后，愈伤组织的量明显增加（图1-B）。将愈伤组织转入A8中进行分化培养，7 d左右即可有不定芽产生（图1-C），30 d后可诱导产生明显的不定芽，继代培养后生长较壮（图1-D）。将叶柄接种到培养基AC4中，30 d后可诱导出较多的愈伤组织，继代培养14 d后愈伤组织的量明显增加（图1-E）。将愈伤组织转入A9 中7 d后，愈伤组织开始分化；经14 d左右的分化培养，愈伤组织开始产生肉眼可见的不定芽（图1-F）。增殖培养后，不定芽的数量明显增多（图1-G）。将不定芽转入R2中诱导生根，经30 d培养可以获得试管苗（图1-H）。

图1 绿萝离体再生的过程Fig.1 The regeneration of Eipremnum aureum in vitro

2.3 p2300-AtFALDH-gfp表达载体的构建

为了转化绿萝，首先要进行表达载体p2300-AtFALDH-gfp的构建（图2-A）。提取拟南芥RNA，反转录为cDNA，通过PCR扩增AtFALDH基因（图2-B）。将回收的AtFALDH基因连入pMD18-T载体。通过PCR和酶切对重组质粒进行鉴定，显示AtFALDH已插入pMD18-T（图2-C、D）。分别酶切p2300-gfp和pMD18-T-AtFALDH，回收连接目的片段。PCR和酶切鉴定结果表明，AtFALDH基因已插入p2300-gfp，从而实现p2300-AtFALDHgfp载体的构建（图2-E、F）。

图2 p2300-AtFALDH-gfp表达载体的构建Fig.2 Construction of p2300-AtFALDH-gfp expression vector

2.4 转化条件的优化

不同处理条件下绿萝的转化率如表4所示。

表4 不同处理条件下绿萝的转化率变化Tab.4 Transformation rate change of Eipremnum aureum under different treatment conditions

为了提高绿萝的转化效率，需对转化条件进行优化，结果表明（表4），当农杆菌的OD600值为0.5时，叶柄愈伤组织的分化率较高，抗性芽较多，但和OD600值为1.0时区别并不显著。侵染时间为5 min时，转化率较低；侵染时间为10 min时，转化率明显提高；侵染时间为15 min时，转化率有所降低，外植体污染率提高。绿萝愈伤组织和农杆菌共培养2 d时，愈伤组织分化率较高，转化效果较好，和共培养1 d时存在显著的差异。

3 结论与讨论

甲醛是室内装修的主要环境污染物，具有强烈的致癌和促癌作用[14]。微生物应对甲醛毒性可归纳为2种机制：利用同化途径固定甲醛以及通过异化途径氧化甲醛最终生成CO2[15]。甲基营养细菌通过3种甲醛同化途径去除甲醛，分别为核酮糖单磷酸途径、丝氨酸途径和核酮糖二磷酸途径[16-17]。而在甲基营养酵母中，甲醛可与谷胱甘肽结合产生S-羟甲基谷胱甘肽，然后经依赖谷胱甘肽的氧化途径形成CO2[6]。该途径需FALDH、S-甲酰谷胱甘肽水解酶（FGH）和甲酸脱氢酶（FDH）共同参与完成[18]。高等植物去除甲醛高度依赖FALDH，在甲醛进入植物组织以及转化为CO2的过程中FALDH都具有重要作用[8]。一些观叶植物具有高效净化甲醛污染的效果，因此，通过绿色植物清除甲醛成为人们首选的生态治理手段[7,19]。即便如此，绿色植物吸收甲醛的能力依然有限。因此，如何更有效的增强植物去除甲醛的能力受到了越来越多的关注。而通过基因工程技术将FALDH基因导入植物，是提高受体植物去除甲醛能力的重要途径之一。高频离体再生体系的建立是植物遗传转化的基础，本研究以绿萝叶片和叶柄为外植体，优化绿萝离体再生条件。试验结果显示，叶片、叶柄都均可诱导产生愈伤组织，但叶柄形成愈伤组织的效果更佳，其中培养基添加0.5 mg/L TDZ和0.5 mg/L NAA有利于叶柄愈伤组织的诱导，这和郭英等[3]、范俊岗[4]、陈广玉[5]的研究结果存在一定的差异，很可能是由于外植体不同造成的。影响愈伤组织分化最主要的植物生长物质是6-BA和NAA。当二者比例合适时，愈伤组织分化产生的不定芽数量较多，生长旺盛；反之，愈伤组织诱导产生的不定芽数量较少，生长迟缓。绿萝叶片和叶柄诱导产生的愈伤组织均可分化为不定芽，但不定芽的分化效果叶柄愈伤组织明显优于叶片。因此，不定芽的诱导率不仅与植物生长物质的比例有关，同时也与愈伤组织的来源有一定的关系。绿萝叶柄愈伤组织分化最适培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。绿萝比较容易生根，当培养基为1/2 MS，生根效果较好。添加一定浓度的NAA，可有效促进生根。由于绿萝叶柄离体再生的频率比较高，因此，本研究采用叶柄愈伤组织作为遗传转化的受体。在农杆菌介导的植物遗传转化中，菌液浓度、侵染时间和共培养时间等条件均会影响到受体的转化效率[20-21]。本研究的结果表明，当农杆菌OD600值为0.5时，易和受体细胞接触，侵染能力强，转化率较高。农杆菌侵染叶柄愈伤组织10 min效果较好，侵染5 min时抗性芽分化率过低；侵染时间15 min时，叶柄愈伤组织容易褐化，污染比较严重。叶柄和农杆菌共培养2 d时效果较好，转化效率高而污染率低。

本研究的结果表明，绿萝叶片在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT培养基中愈伤组织诱导率为61.5%，叶柄在MS+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培养基中愈伤组织的诱导率达到97.8%，并且产生愈伤组织的量较多。将叶片诱导产生的愈伤组织在MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中芽分化较明显，而叶柄诱导产生的愈伤组织在MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中芽分化效果最佳，且叶柄愈伤组织诱导不定芽的效果要优于叶片。不定芽生根最适培养基为1/2 MS+0.05 mg/L NAA。用含p2300-AtFALDH质粒农杆菌转化绿萝，当农杆菌OD600值为0.5，侵染10 min，共培养2 d时，绿萝愈伤组织分化抗性芽的效率较高，转化效果较好。在最适转化条件下，将AtFALDH基因导入绿萝细胞中，经抗生素筛选，初步获得了具有抗性的转基因植株，但其吸甲醛功效还有待进一步验证。