UPLC-ELSD法测定参芪茯苓片中黄芪甲苷的含量*

赵泽林，吴 琼，张丽艳，李 军，周 祥，马四补

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

0 引言

参芪茯苓片由贵州中医药大学与贵州广济堂药业有限公司联合研制以增强免疫力功能为目的的保健食品，由党参、黄芪、茯苓等中药组成，可用于免疫力低下人群。黄芪的主要有效成分为黄芪皂苷。研究表明，黄芪的化学成分有多糖类、皂苷类、黄酮类、生物碱类等[1]。黄酮类大约40种，主要包括4大类[2-3]：黄酮、异黄烷、异黄酮、紫檀烷；多糖类的组成主要是葡聚糖和杂多糖[4]；皂苷类包括黄芪皂苷Ⅰ～Ⅷ、黄芪皂苷甲、黄芪皂苷乙、大豆皂苷等40多种[5]。马晓丰[6]从蒙古黄芪中分离鉴定得到黄芪碱A～F。黄芪中还含有大量的微量元素，如Se、Cr、Cu、Zn、Mn、Co等[7]。现代药理学研究表明，黄芪具有免疫调节[8-10]、抗肿瘤[11-12]、延缓衰老[13]、神经保护以及其他[14-16]抗疲劳、抗病毒、肝脏保护等药理作用。本实验采用(UPLC-ELSD)法测定参芪茯苓片中黄芪甲苷的含量，为进一步研究提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

美国Water 2695液相色谱仪(四元泵洗脱系统、自动进样系统、柱温箱、二极管阵列检测器)，AL204-IC万分之一分析天平(METTLE RTOLEDO仪器有限公司)，HH-4型四孔电热恒温水浴锅(常州华普达教学仪器有限公司)；XS205型电子分析天平(瑞士梅特公司)；800C型粉碎机(永康市红太阳机电有限公司)；80-2电动离心机(常州普天仪器制造公司)。

1.2 试剂与仪器

黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110781-201616，含量为97.4%)，甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，氨水为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，乙腈(美国TEDIA公司)，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent proshell C18色谱柱；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0 min～20 min(95%A～23%A)；蒸发光散射检测器检测。柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；漂移管温度：40 ℃；气体压力：30 psi；增益：30；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品20.03 mg，加入80%甲醇溶液10 mL，定容至刻度，得黄芪甲苷对照品溶液，精密吸取1 mL的黄芪甲苷对照品溶液于10 mL容量瓶中，再加入80%甲醇溶液混匀，定容至刻度，即得浓度为0.2003 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末10 g，精密称定，置具塞锥形瓶内，加4%浓氨试液80%甲醇溶液(取浓氨试液4 mL，加80%甲醇至100 mL，摇匀，即得)50 mL，密塞，称重，加热回流1 h，放冷，补足重量，滤过，取滤液25 mL，蒸干，残渣加80%甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 测定法

精密吸取对照品溶液1 μL、4 μL，供试品溶液2 μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性

取黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液、阴性空白样品溶液各2 μL，分别注入超高效液相色谱仪进行测定。对照品溶液及供试品溶液结果如图1～图2：供试品溶液与对照品溶液保留时间相同，色谱峰相同，空白样品溶液无干扰。

图1 黄芪甲苷对照品溶液Fig.1 Astragaloside IV reference solution

图2 供试品溶液Fig.2 Test sample solution

2.3.2 线性

精密吸取“2.2.1”项下的黄芪甲苷对照品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL，注入液相色谱仪，进行测定。质量对数(X)为横坐标，峰面积对数(Y)为纵坐标进行线性回归。

表1 黄芪甲苷标准曲线Tab.1 Standard curve of astragaloside IV

图3 黄芪甲苷标准曲线图Fig.3 Standard curve of astragaloside IV

结果表明，黄芪甲苷在0.2003～1.0015 μg范围内呈良好线性关系，线性回归方程：Y=1.9225x+4.6687，R2=0.9998。

2.3.3 精密度试验

精密量取“2.2.1”项下的黄芪甲苷对照品溶液2 μL，依次重复进样6次，记录其峰面积分别为5156、4887、5239、5130、5036、5293。RSD为2.85%，表明仪器精密度较好。

2.3.4 稳定性试验

精密称取供试品粉末约10 g，按“2.2.2”项下制备成供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样，峰面积分别为11301、11694、11633、11129、11584、11734。实验结果RSD为2.10%，说明该样品在10 h内稳定性较好。

2.3.5 重复性试验

称取本品粉末(n=6)，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，进行测定，记录峰面积。结果表明，6份样品中黄芪甲苷含量均值为0.2493 mg/g，RSD为1.14%，表明重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

称取本品粉末约5.0 g(含量：0.2493 mg/g)，精密称定(n=6)，分别加入对照品(1.2018 mg)，按“2.2.2”项制备供试品试液，实验结果见表2，回收率均值为103.18%，RSD为0.57%。

表2 加样回收试验结果Tab.2 Spiked recovery rate results

2.4 样品含量测定

取三批参芪茯苓片样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，进行测定，结果见表3。

表3 样品含量测定Tab.3 Results of the content determination

由结果可知，3批参芪茯苓片中黄芪甲苷的平均含量为0.2435 mg/g(即24.35 mg/100 g)。

3 讨论

3.1 仪器的选择

UPLC法和HPLC法相比较有诸多优点，如UPLC法体现出分离度高、结果准确、分析速度快等优点，鉴于其优点本研究采用超高效液相色谱法进行实验。

3.2 流动相选择

本实验通过考察不同体系流动相(水-甲醇，水-乙腈，0.1%磷酸水-甲醇，0.1%磷酸水-乙腈)对参芪茯苓片中黄芪甲苷含量的影响，结果发现当流动相为水-乙腈时，黄芪甲苷分离度好且峰型对称，因此确定水-乙腈为流动相。

3.3 等度与梯度选择

考察了水-乙腈(61∶39)等度洗脱，水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0 min～20 min(95%A～23%A)，结果发现等度洗脱时，黄芪甲苷出峰时间虽较梯度洗脱早，但样品的黄芪甲苷峰型不稳定，故确定为梯度洗脱。

4 结论

近年来随着经济的快速发展，人们的工作与生活方式也逐渐趋于快节奏，各种各样的压力导致亚健康人群愈来愈庞大，机体免疫力呈现下降趋势。参芪茯苓片的研发从营养科学方面着手，以改善亚健康，提升免疫力为目的，为亚健康人群提供选择参考。参芪茯苓片的主成分之一黄芪含有黄酮、多糖等多种化学成分，对机体有补气固表、利尿、敛疮生肌、脱毒等功效[17]，文献表明黄芪在调节机体免疫、促进机体代谢等方面有较强作用[18]。该实验采用UPLC-ELSD法对参芪茯苓片中黄芪甲苷的含量进行测定，结果表明实验方法精密度、稳定性、重复性均符合要求，本实验为后续研究黄芪甲苷相关功效及功能性食品开发奠定基础。