基于脂肪酸组成特征的沙丁鱼油掺伪检测

曹蓉露 陈小娥，* 宋诗军 董芮娟 张 芳 马宇乔 王晓燕

（1浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022；2舟山新诺佳生物工程有限公司，浙江舟山 316101）

鱼油中富含不饱和脂肪酸，随着对鱼油研究的深入以及大众对自身健康的重视，国内外鱼油消费市场逐年扩大，由此导致鱼油原料供应紧张。在利益驱使下，鱼油原料市场掺伪问题日益突出，主要是向高品质鱼油中添加低价值的鱼油，以次充好［1］。鱼油加工企业多采用气相色谱法测定鱼油原料的脂肪酸组成，一般仅关注多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，DHA）含量是否符合标准，而在原料真实性判定方面缺乏科学依据，在质量监管方面存在较大的困难。因此，需要建立一种准确、高效的鱼油掺伪鉴别模型。

化学计量学方法是一类分析方法的统称，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等。近年来，不少学者将这种方法用于油类的掺伪鉴别，并已在山茶油［2］、橄榄油［3］、葡萄籽油［4］等食品中成功应用，但有关鱼油掺伪方面的研究仍鲜见报道。每种鱼都有其特征脂肪酸，掺伪后其特征脂肪酸含量必然会发生改变。鉴于此，本研究拟采用化学计量学方法，结合多元逐步线性回归分析建立掺伪模型，达到高效判别原料真实性的目的。

近年来，沙丁鱼（Sardine pilchardus）因生长快、繁殖能力强等优点而被大量捕获和消费，成为一种被市场认可的鱼油保健品生产原料。沙丁鱼体内含油量较高，鱼油中富含EPA和DHA，具有降低胆固醇、预防心脑血管疾病的作用［5-6］。沙丁鱼油中的棕榈油酸和肉豆蔻酸含量也较高。棕榈油酸不仅在降血糖、预防动脉粥样硬化方面有突出表现，而且还有抑制脂肪生成的功能［7-9］。肉豆蔻酸具有比其他饱和脂肪酸更高的抗氧化活性，有助于α-亚麻酸转化为DHA；长期摄入肉豆蔻酸能够增加骨骼肌中的葡萄糖摄取量，从而避免高血糖的发生［10］。

我国沙丁鱼生产企业的鱼油原料多为进口毛油，由于沙丁鱼毛油进口成本高、资源短缺，沙丁鱼油市场中存在不良厂家用某些价格低廉的鱼油掺伪的问题。本研究以沙丁鱼油为试验对象，采用气相色谱仪测定沙丁鱼及几种可能掺伪海水鱼的脂肪酸组成，利用PCA分析和PLS-DA分析找出可能掺伪的鱼种以及沙丁鱼油的特征脂肪酸，同时结合多元逐步线性回归分析建立掺伪鉴别模型，以期为今后鉴别鱼油掺伪提供新的思路，为沙丁鱼油原料的质量控制及后续开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙丁鱼油、鳀鱼油各18批，带鱼油、鲣鱼油和鲐鱼油各15批，均由浙江舟恒海洋生物科技有限公司提供；白姑鱼共15批，购于舟山丰茂菜场；甲苯、甲醇、正己烷均为色谱纯，默克化工技术（上海）有限公司；甲醇钠、无水硫酸钠均为分析纯，国药集团化学试剂上海有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；TDZ5-WS低速多管离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；HH-6系列恒温水浴锅，金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 油样制备鱼油样品准备：取沙丁鱼油、鳀鱼油、带鱼油、鲣鱼油和鲐鱼油直接进行后续试验。白姑鱼油为实验室条件下制备，提取步骤参照宋恭帅等［11］的方法。

沙丁鱼油掺伪油样制备：沙丁鱼油中分别掺入质量分数为10%、20%、30%、40%、50%的待混鱼油（如100 g的10%掺伪油，即将10 g鳀鱼加入到90 g沙丁鱼油中混合而成），进行气相色谱分析，每组5个平行样。

1.3.2 脂肪酸分析脂肪酸甲酯化：取25 mg鱼油样品于具塞玻璃试管中，先加入1 mL甲苯和2 mL 0.5 mol·L-1甲醇钠溶液，再往具塞玻璃试管中充氮气并盖好盖子，充分振摇后，置于50℃水浴中反应1 h。待冷却至室温后，加入1 mL饱和食盐水和2 mL正己烷，充分振荡，1 500 r·min-1离心10 min。取离心后的上层液于装有2 mL蒸馏水的干净试管中，振摇，静置。最后，取静置后的上层液于盛有无水硫酸钠的试管中，摇匀后装入具塞试管［12］。

气相色谱条件：安捷伦Hp-innowax 60 m色谱柱（60 m×0.32 mm×0.50µm）；进样口和检测器温度均保持在270℃；载气为高纯氮气，进样量1 µL，流速1 mL·min-1，分流比1∶10。升温程序：起始温度180℃，保持2 min；以10℃·min-1的速度升温至210℃，保持3 min；然后以10℃·min-1的速度升温至230℃，保持12 min；最后以10℃·min-1的速度升温至250℃，保持18 min。

1.3.3 脂肪酸相对含量计算采用面积归一化法计算样品的脂肪酸相对百分含量［13］，每组5个平行样。试样中某个脂肪酸的相对含量（）按下式计算：

式中，Ai为测定液中各脂肪酸甲酯的峰面积；Fi为各脂肪酸甲酯组分转换成脂肪酸的系数。

1.4 化学计量学分析

对6种鱼油样品的脂肪酸数据进行PCA分析，PCA分析提取前2个主成分，当总贡献率（principal component，PC）达到80%以上［14］，即表示主成分包含所测样品的大部分信息。

对掺伪鱼油进行PLS-DA分析，将分类Y矩阵的变量随机排列200次得置换检验图，当模型解释率参数（R2）与Y轴的截距小于0.3，模型预测能力参数Q2与Y轴的截距小于0.05时，说明PLS-DA分析具有较好的判别准确性［15-16］。VIP代表每个样品在PLS-DA分析中样本的贡献度，一般认为VIP值大于1的变量为显著变量［17］。

1.5 掺伪数学模型建立及验证

本研究的沙丁鱼油掺伪鉴别模型在SPSS 25软件中构建，建立以沙丁鱼油特征脂肪酸含量为自变量（X），掺伪百分含量为因变量（Y）的多元逐步线性回归模型。本研究中的掺伪百分含量为：

式中，a1，a2…an为待定系数；a0，b为常数。

建立模型后，取沙丁鱼油和鳀鱼油各3批样品进行模型准确性验证。将质量分数为10%、20%、30%、40%、50%的鳀鱼油掺入沙丁鱼油中，每种质量分数为一组，另取沙丁鱼油样品为一组，共6组进行验证。每组5个平行样，最终结果取各组平均值。

1.6 数据处理

脂肪酸数据以平均值±标准偏差的形式表示，在SPSS 25软件中，采用Duncan新复极差法对脂肪酸数据进行差异显著性分析，P<0.05则认为差异存在统计学意义；采用Origin 2021软件对6种鱼油样品的脂肪酸数据进行PCA分析；采用SIMCA 14.1软件对掺伪鱼油进行PLS-DA分析，并运用SPSS 25软件建立掺伪数学模型。

2 结果与分析

2.1 6种鱼油脂肪酸组成分析

由表1可知，沙丁鱼油中饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）含量为39.40%，其中棕榈酸（C16∶0）的含量最高，为20.88%。不饱和脂肪酸含量为60.60%，包括3种多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和4种单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA），含量分别为32.15%和28.45%，其中EPA（C20∶5）含量为18.55%，DHA（C22∶6）含量为11.73%，EPA含量大于DHA，这与张蒙娜等［18］的研究结果一致。

从表1还可以看出，沙丁鱼油的脂肪酸组成中棕榈酸（C16∶0）、油酸（C18∶1）和EPA所占比例超过50%，占比越高越具有代表性，说明这3种脂肪酸有可能是沙丁鱼油的特征脂肪酸。值得一提的是，油酸不仅对黄曲霉毒素引发的肝细胞损伤具有保护作用［19］，而且还能减轻镉诱导的氧化损伤，从而减缓人体镉中毒的反应［20］。通过与另外5种鱼油进行比较发现，沙丁鱼油脂肪酸组成中肉豆蔻酸（C14∶0）、棕榈油酸（C16∶1）和EPA含量整体显著高于其他5种鱼油，也可能是沙丁鱼油的特征脂肪酸。因此，可以考虑将棕榈酸、油酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸和EPA作为特征脂肪酸。

表1 6种鱼油脂肪酸组成Table 1 Fatty acid composition of six fish oils

2.2 6种鱼油脂肪酸比值分析

为了比较不同鱼油脂肪酸组成的差异，对EPA/C18∶1、（C14∶0+C16∶1）/C18∶1和C16∶1/C16∶0的脂肪酸比值进行比较分析（图1）。结果表明，3组脂肪酸比值存在不同程度的差异。EPA/C18∶1的比值位于0.41～1.18之间，鳀鱼、鲐鱼、鲣鱼和沙丁鱼的比值较为接近；鲣鱼、白姑鱼（C14∶0+C16∶1）/C18∶1的比值位于0.25～0.26之间，而鲐鱼、带鱼、鳀鱼（C14∶0+C16∶1）/C18∶1的比值位于0.75～1.21之间，与沙丁鱼的比值（1.23）相近；C16∶1/C16∶0的比值从大到小依次为沙丁鱼>鳀鱼>鲐鱼>带鱼>白姑鱼>鲣鱼。综上，鳀鱼、鲐鱼和沙丁鱼的脂肪酸比值最为接近，说明其可能具有相似的脂肪酸特征，可对其进行进一步比较。

图1 6种鱼油脂肪酸比值分析Fig.1 Fatty acid ratio analysis of six fish oils

2.3 6种鱼油主成分分析（PCA）

通过PCA分析可对数据进行降维处理，将多个变量转化为少数几个综合变量。以主成分作为新坐标，通过SIMCA-P11.5软件对数据进行投影分析，达到高维数据的低维直观可视化［21］。

为了验证上述结果，将表1中6种鱼油的脂肪酸组成作为数据集，进行PCA分析（图2）。第一主成分贡献率为63.7%，第二主成分贡献率为26.1%，总贡献率为89.8%，具有良好的代表性［14］。从图2还可以看出，沙丁鱼油与鳀鱼油较为接近，与其他几种鱼可以明显区分，表明沙丁鱼油脂肪酸与鳀鱼油脂肪酸主成分特征相近，证明鳀鱼油具备掺伪沙丁鱼油的条件。因此选择鳀鱼鱼油进行后续试验。

图2 6种鱼油脂肪酸PCA得分图Fig.2 PCA score chart of six fish oil fatty acids

2.4 掺伪鱼油偏最小二乘判别分析（PLS-DA）

PLS-DA分析可以预设分类，并量化特征化合物造成组分差异的程度［21］。为找出掺伪油的脂肪酸组成特征，本研究将沙丁鱼油和不同质量分数梯度的鳀鱼油脂肪酸组成作为数据集，进行PLS-DA分析（图3）。结果表明，50%鳀鱼油掺伪（26～30）与沙丁鱼油（1～5）存在明显区别，而10%鳀鱼油掺伪（6～10）与沙丁鱼油距离较近，说明沙丁鱼油在少量掺伪时差异较小，不易区分。PLS-DA分析共提取5个主成分，主成分总贡献率为85.65%。由表2可知，R2X为0.947，R2Y为0.696，Q2为0.515，均大于0.5，说明所建模型具有较强的解释率和预测力［22］。

图3 掺伪油脂肪酸PLS-DA得分图Fig.3 PLS-DA score chart of adulterated oil fatty acids

表2 掺伪油脂肪酸PLS-DA拟合结果Table 2 PLS-DA fitting results of adulterated fatty acids

为了验证PLS-DA分析是否存在过度拟合现象，将分类Y矩阵的变量随机排列200次做置换检验，结果见图4。R2拟合直线在Y坐标轴的截距为0.148，小于0.3，Q2拟合直线在Y坐标轴的截距为-0.427，小于0.05，说明PLS-DA分析结果可靠［16］，不存在过度拟合现象，能够对掺伪沙丁鱼油进行判别分析。

图4 PLS-DA的200次置换检验图Fig.4 200 permutation test chart of PLS-DA

变量投影重要性（variable important in projection，VIP）可以用于评价各个变量对分类的贡献程度，当VIP值大于1，即认为其在判别过程中有重要作用［23］。图5为掺伪油脂肪酸PLS-DA分析的VIP得分图，结果表明，EPA、DHA、棕榈酸、棕榈油酸、二十二碳烯酸和油酸这6种脂肪酸VIP值均大于1，可作为掺伪油的特征脂肪酸。

图5 掺伪油脂肪酸PLS-DA分析的VIP得分图Fig.5 VIP score diagram for PLS-DA model of adulterated oil fatty acid

2.5 基于多元逐步线性回归分析的沙丁鱼油掺伪鉴定

2.5.1 沙丁鱼油掺伪鉴别模型建立多元逐步线性回归分析是将变量逐个引入的分析方法，将变量逐个引入的同时去除不显著的变量，得到模型的最优解［24］。表3为沙丁鱼油掺伪鉴别模型，此模型以沙丁鱼油特征脂肪酸含量为自变量，以掺伪百分含量为因变量，将6个特征脂肪酸作为变量逐步引入，经软件计算最终得到5个鉴别模型。其中模型1的R2为0.775，小于0.9，表明模型1预测准确性较低，故不作为后续预测的掺伪模型。其余模型R2均大于0.9，P<0.000 1，说明模型2～5较可靠，具有现实意义。

表3 沙丁鱼油掺伪鉴别模型Table 3 Identification model of sardine oil adulteration

2.5.2 沙丁鱼油掺伪鉴别模型的可行性验证对模型2～模型5进行绝对误差分析，所得结果见表4。模型2到模型5的误差范围分别为0.88%～4.47%、-0.27%～3.94%、0.37%～2.43%、-0.79%～1.68%，4个模型的平均误差分别为2.20%、1.38%、1.19%、0.83%，平均误差均小于5%，说明此模型在鉴定沙丁鱼油掺伪方面具有可行性，可以用于今后沙丁鱼油掺伪的检测。

表4 沙丁鱼油掺伪模型预测值与实际值的误差Table 4 The error between predicted value and actual value of sardine oil adulteration model /%

3 讨论

针对鱼油原料市场存在的掺伪现象，国内外学者进行了大量研究，目前的掺伪鉴别方法主要是利用气相色谱法对鱼油脂肪酸的特征进行分析比较。如王琼芬等［25］采用气相色谱法测定鳕鱼肝油脂肪酸组成，发现DHA/EPA和鲸蜡烯酸的含量在掺入一定量的鱼油后会发生改变，由此初步建立了鳕鱼肝油的掺伪识别模型，但由于样本量不够大，这种方法并不能保证所测脂肪酸比值的唯一性，所得掺伪模型存在准确性不高的问题；孙亚娟等［26］通过不同杏仁油的挥发性成分来建立杏仁油的指纹图谱，并在此基础上建立菜籽油-掺伪杏仁油的鉴别模型，虽然运用指纹图谱建立掺伪模型能提高鉴别准确性，但其工作量较大、性价比低，不利于推广应用；应美蓉等［27］分析山茶油及其掺伪油的特征脂肪酸后，将特征脂肪酸代入回归方程，建立了山茶油的掺伪预测模型，研究证实利用特征脂肪酸和回归方程建立掺伪模型，具有一定的合理性、可操作性。因此，本研究在此基础上进行优化，利用脂肪酸比值和化学计量学方法，分析鱼油脂肪酸特征，再采用多元逐步线性回归分析建立掺伪鱼油模型。

近年来，主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、偏最小二乘法（PLS）和线性判别（linear discrimination analysis，LDA）等化学计量学方法在食品领域逐渐兴起，主要用于鉴别食品掺伪或产地溯源。PCA分析可以通过降维达到数据的可视化，帮助研究者进行数据分析和理解。对于PCA分析后无法再区分的样品，可以联用LDA分析来达到产地溯源的目的。如袁玉伟等［28］运用PCA-LDA分析方法鉴别不同产地的茶叶，通过PCA分析有效提取出数据中的信息，从而达到LDA分析的样本标准，将PCA分析无法处理的样本进行区分，建立产地鉴别模型，模型准确率最高达99%，可信度较高；胡桂仙等［29］根据稳定同位素与多元素的特征来进行PCA-LDA分析，利用PCA分析对杨梅产地进行初步分类，在此基础上，根据样本类内方差最小且类间方差最大的原则，采用LDA分析进一步细分建模，从而达到杨梅产地溯源的目的。虽然PCA-LDA分析能够较好地实现产地鉴别的目的，但此方法更适合样本量大、组成成分多的客体。PLS-DA分析属于无监督模式的分析，更能关注不同变量之间的差异，筛选出特征化合物。而PLS分析可以处理大样本中的多重共线性问题，弥补PLS-DA分析的不足。Shi等［2］采用PCA分析对纯植物油进行分类，找出脂肪酸组成接近山茶油的植物油并将其作为研究对象，利用PLS-DA分析区分不同品种的掺伪油，最后通过PLS分析预测山茶油中其他植物油的掺伪百分比，完成对山茶油的定量掺伪鉴别。可见利用PCA分析结合PLS-DA分析预测样品掺伪油具有一定的可行性，故本研究选取PCA和PLS-DA分析两种化学计量学方法，通过PCA分析初步判断出可能的掺伪油，进一步利用PLS-DA分析得到掺伪油的特征脂肪酸，所得结果准确可靠。

多元逐步线性回归分析在向前引入每一个新自变量之后，都要重新对已代入的自变量进行计算，以验证其是否有继续留在方程中的价值，以此为依据交替引入和剔除自变量，直到没有新的变量可以引入或剔除为止［30］。黄丽等［31］通过多元逐步线性回归分析建立了水牛乳掺水的定量模型，能快速、有效地监控水牛乳掺水情况；邹光宇等［32］在电子鼻检测的基础上，利用多元逐步线性回归分析等方法建立茶叶样品中茶多酚、咖啡碱含量的预测模型，达到了快速鉴别茶叶品质的目的。不同海区的沙丁鱼脂肪酸含量会受生长环境、温度、食物链等影响而发生变化，但其本身的特征脂肪酸组成是稳定的。因此，本研究采用多元逐步线性回归分析建立沙丁鱼油掺伪鉴别模型。选取R2大于0.9的模型进行验证，结果表明各模型平均误差均小于5%，说明其具有鉴别沙丁鱼油掺伪的应用价值。

4 结论

本研究运用化学计量学方法及多元逐步线性回归分析建立了沙丁鱼油掺伪鉴别模型。脂肪酸组成分析和PCA分析结果表明，鳀鱼油与沙丁鱼油脂肪酸组成最为相似，可作为沙丁鱼的掺伪油；PLS-DA分析选取出的VIP值大于1的脂肪酸因子为EPA、DHA、棕榈酸、棕榈油酸、二十二碳烯酸和油酸，可以作为掺伪油的特征脂肪酸；本研究以特征脂肪酸含量为自变量，以掺伪百分含量为因变量，运用多元逐步线性回归分析建立的掺伪鉴别模型可有效鉴别沙丁鱼油掺伪。