CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

冯 源 刘烨方 寇晓虹 薛照辉

（天津大学化工学院，天津 300350）

果实成熟是一个复杂的过程，受内外因素的共同影响。在转录水平上，果实成熟受多种转录因子调控［1-2］。研究发现，乙烯响应因子（ethylene response factor，ERF）［3］、锌指型转录调控因子（WRKY）、含有高度保守的DNA结合区-MYB结构域的一类转录因子（v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）、碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）、NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）等转录因子在果实成熟过程中显著激活［4］。其中NAC转录因子在植物生长发育、果实成熟和植株衰老等过程中发挥重要作用［5-7］。NOR-like1直接与乙烯生物合成、颜色变化和胞壁代谢基因的启动子结合，并正向调控上述基因的 表 达［8］。SlNAC1抑 制SlACS2、SlACS4、SlACO1和SlPSY1的表达，通过乙烯和脱落酸（abscisic acid，ABA）依赖途径调控番茄果实成熟［9］。Kou等［10］从NAC家族中分离出与番茄成熟相关的SNAC4/9基因；还有研究表明SNAC4和SNAC9可以直接结合在ACS2、ACS4的启动子上，SNAC4/9在蛋白水平上与ABA和乙烯相关基因（SAPK3、SlPYL9、SlAREB1、SlACS2和SlACO1）存在互作，可能协同调控果实成熟［11］。SNAC4/9与植物激素互作，成为番茄果实成熟调控网络的一部分［12-13］。

基因组编辑技术可以实现对一个或多个目的基因的敲除，也可以通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达［14-15］。CRISPR/Cas9技术是在大肠杆菌的基因组中发现的，能在体内精确地定向修改DNA序列，产生特异性突变并于2014年应用于园艺作物［16］。CRISPR/Cas9技术目前已成功应用于番茄、拟南芥和水稻等作物以诱导有价值的性状［15，17］，在番茄中的应用主要集中在果实品质提高、品种驯化以及对生物和非生物胁迫抗性等方面［18］。

目前已经成功鉴定了一些CRISPR/Cas9介导的番茄成熟调控突变体［19］。Li等［20］利用该技术研究了长链非编码RNA（lncRNA1459）番茄功能缺失突变体，发现乙烯产生和番茄红素积累受到显著抑制。Ito等［21］应用CRISPR/Cas9系统证实了RIN对果实完全成熟的重 要 性。Gao等［22］利 用CRISPR/Cas9技 术 获 得 了SlNAM1缺陷型突变体，发现SlNAM1通过调节乙烯生物合成正向调节番茄果实成熟的开始。Gao等［8］发现CRISPR/Cas9-NOR-like1敲 除 和VIGS-NOR-like1沉默的番茄果实中番茄红素积累降低，成熟延迟。天津大学化工学院果实品质生物学课题组前期利用VIGS技术研究发现沉默SNAC4/9基因导致番茄果实中的ABA含量和果实软化速率呈现相反的变化规律［23］，推测SNAC4/9可能从不同的路径调控番茄果实成熟，进而导致硬度和激素含量出现差异，深入研究需要获得遗传稳定、多靶点的突变体材料。

本研究利用多靶点CRISPR/Cas9基因高效编辑系统构建SNAC4/9单基因和双基因敲除番茄突变体，T0和T1代种植收获后，对靶修饰位点进行PCR扩增并测序，解析CRISPR/Cas9技术定点编辑后敲除靶点的遗传稳定性和差异性，对敲除成功的植株和果实进行分析，旨在为深入探究SNAC4/9调控番茄果实成熟的机制和构建协同调控网络提供科学依据和典型突变体材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料Micro-Tom品种番茄，保存于天津大学化工学院果实品质生物学实验室。

1.1.2 菌株与质粒中间载体pYLgRNA和双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H由华南农业大学刘耀光课题组惠赠；大肠感受态细胞DH10B和农杆菌感受态细胞GV3101购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1SNAC4/9单靶点、双靶点和多靶点的CRISPR载体构建采用在线软件CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/home/）和CRISPR-P 2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）设计靶点。活化含有pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的甘油菌和含有pYLgRNA中间载体的甘油菌，通过无内毒素质粒大提试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）和质粒小提试剂盒（全式金生物技术股份有限公司，北京）提取质粒。检测质粒质量和BsaI限制性内切酶活性［18］。采用带有靶序列的引物（靶点引物U#-T#和gR-T#），利用重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法，将靶点引入至启动子和sgRNA骨架之间，构成sgRNA表达盒（图1）。主要通过两轮PCR反应［18］实现sgRNA表达盒的构建（图4-A）（引物见表1），反应结束后，分别用琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。采用金门分子（golden gate）克隆方法，将多个sgRNA表达盒以边切边连的形式克隆至pYLCRISPR/Cas9载体中（图4-A）。将载体分别转入DH10B和GV3101后，挑取转化后的单菌落，于3 mL含相应抗生素的液体培养基中，于37℃（大肠）或28℃（农杆菌）、180 r·min-1条件下培养至液体浑浊。取菌液进行PCR反应，体系程序参考文献［18］。将经菌液PCR鉴定后条带大小符合预期的载体菌株进行测序，采用引物SP-R和U#-T1检测载体中第一个靶点，采用引物gR-T1和U#-T2检测第二个靶点（图2），以此类推，采用引物gR-Tn和SP-L1检测最后一个靶点。

图1 pYLgRNA和sgRNA表达盒示意图Fig.1 Schematic diagram of pYLgRNA and sgRNA expression cassettes

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

表1 （续）

图2 载体中靶点检测策略Fig.2 Strategy for target sequencing in the construct

1.2.2 农杆菌介导的番茄遗传转化选取SNAC4基因编辑载体（5号）和双基因编辑载体（15号）委托陕西博瑞德生物科技有限公司进行遗传转化，选取SNAC4基因编辑载体（11号）、SNAC9基因编辑载体（14号）和双基因编辑载体（16号）委托武汉伯远生物科技有限公司进行遗传转化。转化成功后，采用TransDirect Plant Tissue PCR Kit试剂盒（全式金生物技术股份有限公司，北京）以及Cas9基因特异性引物进行PCR检测，筛选阳性植株。

1.2.3 突变体鉴定及脱靶位点检测在每个靶点上下游100～300 bp处设计特异性引物（表2），用2×Rapid Taq Master Mix扩增带有靶序列的片段，PCR产物胶回收纯化后，进行Sanger测序，利用ContigExpress 9.1.0.424和DSDecodeM（http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/）软件分析测序结果。将PCR产物测序结果解码失败的片段连T载体测序。利用CRISPR-P和CRISPR-GE进行脱靶位点预测，每个靶点选取脱靶分数较高、位于基因区的2个脱靶位点进行检测。

表2 T0代靶点扩增和测序引物Table 2 Primers used for targets amplification and sequencing in T0generation

2 结果与分析

2.1 SNAC4/9-CRISPR/Cas载体的构建

为研究不同靶点的剪切效率以及构建多靶点载体，在SNAC4的第一、第二外显子区和SNAC9的3个外显子区均设计了靶点（图3）。在SNAC4/9基因的编码区（coding sequence，CDS）分别设计了5和6个靶点（表3）。SNAC4靶点命名为4T1～4T5，SNAC9靶点命名为9T1～9T6。

表3 SNAC4/9靶点信息Table 3 Information of SNAC4/9 targets

图3 SNAC4/9基因序列上的靶点分布Fig.3 Targets distribution on SNAC4/9 gene sequence

选取4T1～4T5和9T1～9T5靶点分别构建10个单基因单靶点载体；组合靶点4T1/4T3、4T3/4T5、9T1/9T4和9T4/9T5分别构建单基因双靶点载体；组合靶点4T1/9T2和4T2/9T3分别构建双基因双靶点载体；组合靶点4T1/4T5/9T6/9T5构建双基因四靶点载体（图4-A）。由电泳结果（图4-B）可知，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒经BsaI酶消化后，产物为2个线性化片段，分别为15 731和689 bp。pYLgRNA中间质粒上存在3个BsaI酶切位点，酶切产物为3个线性化片段。从pYLsgRNAAtU3d/LacZ质粒扩增获得单靶点载体的sgRNA表达盒以及双靶点载体的第一个sgRNA表达盒（图1），从pYLsgRNA-AtU3d质粒扩增获得双靶点载体的第二个sgRNA表达盒。启动子和靶点确定后，CRISPR-GE软件可直接生成带有靶点的引物U#-T#和gR-T#，用于第一轮PCR反应。验证发现，各泳道均可见2条较为明亮的条带，为第一轮PCR反应的两个产物（图4-C）。第二轮PCR反应后，单靶点载体的LacZ-AtU3dsgRNA表达盒条带大小与预期的495 bp相符（图4-D），双靶点载体的LacZ-AtU3d-sgRNA表达盒和AtU3dsgRNA表达盒的条带大小分别与预期的490和289 bp相符（图4-E）。

图4 SNAC4/9-CRISPR/Cas载体的构建Fig.4 Construction of SNAC4/9-CRISPR/Cas vector

将纯化后的表达盒与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒进行酶切连接反应，使表达盒组装至CRISPR/Cas9载体。阳性克隆鉴定分析以LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR载体为例（图5）。菌液组条带大小与预期的447、274和188 bp相符，对照组无条带，表明连接产物转化成功（图5-A）。由BLAST分析可知，CRISPR/Cas9载体中连入的两个sgRNA表达盒测序结果与参考序列完全一致（图5-B），载体构建成功。其余9个单靶点载体、4个双靶点载体和1个四靶点载体经菌液PCR检测和Sanger测序，确定构建成功。进一步转化GV3101农杆菌，菌液PCR检测，鉴定阳性克隆。双靶点载体和两个单靶点载体的检测结果如图6所示，单克隆1和2的两条带大小均与预期的447和188 bp相符，单克隆3的三条带大小均与预期的447、274和188 bp相符，表明质粒转入农杆菌成功，且表达盒结构在农杆菌中未发生变化。综上，本研究成功构建了15个CRISPR/Cas9基因编辑载体（表4）。

表4 载体信息汇总表Table 4 The information of vectors

图5 LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR载体转化DH10B的阳性克隆鉴定Fig.5 Identification of DH10B positive clone transformed with LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR vector

图6 LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR载体转化GV3101的阳性克隆鉴定Fig.6 Identification of GV3101 positive clone transformed with LacZ-AtU3d-4T1-AtU3d-4T3-CRISPR vector

2.2 转基因阳性苗的获得

以5号载体为例，番茄子叶作为外植体，与载体农杆菌共培养后，经诱导培养产生愈伤组织，再经分化培养长出再生芽，进而生根形成幼苗（图7）。对生根后的幼苗叶片进行Cas9基因PCR检测。载体转化成功的阳性苗PCR产物大小为572 bp。5号载体转化番茄共得到12株阳性苗（图8）。11、14、15和16号载体转化的番茄株系分别获得16、15、12和14株阳性苗。

图7 农杆菌介导的番茄遗传转化Fig.7 Tomato transformation by Agrobacterium

图8 阳性苗检测Fig.8 The identification of positive transgenic plants

2.3 靶位点序列突变类型分析

两条染色体突变结果相同代表纯合突变。将靶点测序结果与野生型序列（wild type，WT）比对分析发现，构建的CRISPR/Cas9载体在PAM基序上游约3 bp处进行剪切，产生多种类型的突变体（图9）。具体基因突变类型为单个或多个碱基对的缺失、替换和插入。例如，在5号载体转化的12株阳性苗中，有3株不同数量碱基对缺失的纯合子5（SNAC4）-8、5（SNAC4）-9和5（SNAC4）-11，1株双等位基因突变体5（SNAC4）-12，7株嵌合体。特别是，14（SNAC9）-20和14（SNAC9）-57突变体的9T4靶点发生了大片段序列的缺失。5、11、14和16号载体在番茄植株体内编辑后分别产生11、7、9和7株突变体。16号双基因编辑载体产生的7株突变体中，16（SNAC9）-20号为双基因突变体。

图9 载体转化阳性苗的部分测序结果Fig.9 Partial sequencing results of positive seedlings

2.4 脱靶位点的检测

为保证突变苗相对于对照苗的差异由目的基因被编辑引起，随机选取了靶点被成功编辑的突变苗进行突变靶点的2个可能脱靶位点检测（表5）。结果表明，SNAC4靶点（4T2/4T3/4T5）和SNAC9靶点（9T3/9T4/9T5）的可能脱靶位点均未被编辑，说明构建的CRISPR/Cas9载体系统在番茄中具有较高的特异性。

表5 可能的脱靶位点检测Table 5 Detection of mutations on putative off-target sites

2.5 T0代突变体果实表型鉴定

观察破色期（breaker，B）至破色后19 d（B+19）果实的表型（图10）发现，由B+3至B+19时期，对照果实由黄转红，而各突变体的果实颜色由黄变橙，对照果实不同成熟时期的颜色明显深于突变体，表明SNAC4/9基因的敲除影响果实中番茄红素的积累。在B+10时期，对照果实处于完全成熟状态呈深红色，而敲除果实呈橙色，且后期颜色并未加深，表明敲除番茄中SNAC4或SNAC9基因导致番茄果实不能完全成熟。此外，本研究发现16-20双基因敲除果实在B+3时期的颜色明显黄于其他4种突变体和对照组，推测SNAC4/9调控类胡萝卜素代谢机制不同，导致SNAC4/9双基因敲除对果实色素积累的影响更大。

图10 T0代突变体果实不同成熟时期表型Fig.10 Phenotypes of T0mutant fruits during different ripening stages

2.6 筛选CRISPR-SNAC4/9-T1代番茄稳定遗传株系

T0代突变体收种后，拟筛选稳定遗传的SNAC4/9基因敲除突变体进行分析。通过比较T0代果实种子数量发现，CRISPR-SNAC9#13-3、13-5、14-57、14-61的种子数量较多（图11）。通过比较T0代果实种子大小发现，CRISPR-SNAC4种子略小于野生型，饱满度低 于WT和CRISPR-SNAC9#13-3/5组；CRISPRSNAC9#14-57组种子小于野生型，饱满度更低。挑选SNAC4基因编辑载体（5和16号）的T0代突变体（5-11、5-12、16-22）和SNAC9基因编辑载体（13和14号）的T0代突变体（13-3、14-57、14-61）的种子进行种植，获得了SNAC4/9-T1代敲除突变体，统计不同种子的发芽率、结实率和植株生长情况，筛选发芽率高、稳定遗传的植株及果实进行分析。结果表明，WT种子的发芽率为86.67%，13-3的发芽率为92.59%，CRISPR-SNAC4种子的发芽率较低，CRISPR-SNAC9-13种子的发芽率最高。说明SNAC4/9基因的敲除在不同程度上影响种子形态和发芽率，不同载体之间也存在差异。

图11 T0代番茄果实种子Fig.11 Seeds of T0generation tomato fruit

对5株T1代CRISPR-SNAC4突 变 体 和32株CRISPR-SNAC9突变体进行鉴定。比对分析发现（图12），5（SNAC4）-11-1（简作5-11，下同）植株中有2株为纯合突变，具体突变为4个碱基对的缺失。16-22杂合子的2株后代被鉴定为纯合突变，具体突变为1个碱基对的插入。13号载体中，共成活29株植株，有23株突变体被鉴定为纯合突变，其中，有10株为双靶点突变，值得注意的是，13-3后代的9T1和9T4靶点发生了大片段序列的缺失。14号载体中，有3株植株被鉴定为纯合突变，其中，14-57-1的T4靶点发生了41 bp的缺失，T5靶点发生了1个碱基对的插入；14-61-1具体突变为9T5靶点，有1个碱基对的插入；14-61-2具体突变为9T4靶点，有1个碱基对的缺失。其中，编号14-57-1、13-3-1、13-3-6、13-3-7、13-3-8、13-3-9、13-3-17、13-3-18、13-3-19、13-3-23、13-3-27为双靶点突变。说明CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶修饰位点在代际之间得到了稳定遗传。

图12 T1代突变体测序结果Fig.12 Sequencing results of T1generation mutants

T1代转基因植株的生长发育及开花坐果如图13所示。野生型果实于花后17 d结果，40 d破色，CRISPR-SNAC4/9敲除果实的结果期和破色期均比野生型晚，且颜色变化缓慢。CRISPR-SNAC9突变体的坐果率小于野生型；与CRISPR-SNAC9突变体相比，CRISPR-SNAC4发芽率和结实率低，说明SNAC4对植株长势的影响更大。推测SNAC4/9可能通过影响植株生长发育进而影响坐果和果实成熟。对比果实表型，可以看出SNAC4/9的敲除延缓了果实成熟。B+12时期WT果实已明显红变，SNAC4敲除果实呈黄色，SNAC9敲除果实呈橙色。表明SNAC4/9基因的敲除影响果实中类胡萝卜素代谢。

图13 T1代CRISPR-SNAC4、CRISPR-SNAC9和野生型植株表型Fig.13 T1 generation CRISPR-SNAC4，CRISPR-SNAC9 and WT plant phenotypes

3 讨论

本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除番茄SNAC4/9，利用CRISPR/Cas9系统传递Cas9核酸酶和sgRNA进入番茄细胞，部分植株实现了SNAC4/9基因靶点的DNA碱基或片段的缺失、替换和插入（图9）。sgRNA的序列、高级结构以及表达方式对CRISPR/Cas9的基因编辑效率有显著影响［24-26］，本研究选择了能形成完整、稳定的sgRNA二级结构的靶点，包含茎环RAR、茎环1和茎环2（图14），T0代植株的编辑效率达到49.27%，但纯合突变率还有待提高（图15）。目前有许多关于优化sgRNA和Cas蛋白启动子的研究，提出了提高基因打靶效率的新方法［27］。如Yang等［28］使用附加型sgRNA质粒和稳定的整合Cas9调整了CRISPR/Cas9系统，实现了100%的基因组编辑效率。未来可以尝试CRISPR/Cas9系统优化的新技术，提高基因敲除效率。

图14 4T1靶点形成的sgRNA二级结构图Fig.14 Secondary structure of sgRNA with 4T1

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，本研究共获得T0代SNAC4基 因 突 变 体24株，SNAC9基 因 突 变 体21株，SNAC4/9双基因突变体1株。不同靶点的编辑效率存在差异（图15-A），4T5和9T5靶点具有较高的纯合突变率；4T5的靶点突变率最高，高达91.7%；4株T1代SNAC4和26株SNAC9突变体均为纯合突变（图15-B）。T1代13-3中10株番茄的9T1靶点突变，突变率为34.48%；9T4靶点突变23株，突变率为79.31%，9T4靶点突变率较高。而且从发芽率看，T1代CRISPR-SNAC9-13植株的发芽率比野生型高出5.92%。故筛选13-3为稳定遗传株系作为后续重点研究材料。特别是，16-22株系为杂合子，T0代编辑效率为50%，其T1代株系均为纯合子，说明4T2靶点在代际之间可以稳定遗传。来源于纯合突变体T0-5-11的所有后代群体的靶修饰位点序列都与亲代保持一致；在双靶点编辑T0-13-3的后代中，T1靶点突变均为32个碱基的缺失，而T4靶点突变植株中，有18株是9 bp的缺失，和T0代相同；有4株是41 bp的缺失，除靶点之外还有其他碱基的突变。说明CRISPR/Cas9系统基因编辑后的突变序列在代际之间稳定遗传可能与靶点有关，基因序列不同位点的突变对相应蛋白功能的影响存在差异，后续将比较不同靶点的敲除对番茄成熟的影响，进一步阐明遗传稳定性与靶点之间的规律性。

图15 各靶点突变类型Fig.15 Specific types of each target

本研究通过分析T1代番茄突变果实发现，SNAC4/9基因的敲除影响果实中类胡萝卜素代谢（图13），SNAC4敲除后的果实比SNAC9敲除后的成熟进程更加缓慢，研究结果印证了课题组前期利用VIGS技术沉默SNAC4/9的研究结果［23］，表明了SNAC4/9调控番茄果实色素代谢的差异性。此外，研究中发现不同突变体植株呈现出对病虫害的抗逆差异性，后续可以基于不同靶点SNAC4/9基因编辑番茄材料开展SNAC4/9调控番茄抗逆性等方面的系统研究。

4 结论

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除番茄SNAC4/9基因。成功构建单靶点和多靶点载体，遗传转化后获得阳性苗，结合突变株系的序列分析结果及潜在脱靶位点验证，获得T0代SNAC4基因突变体24株，SNAC9基因突变体21株，SNAC4/9双基因突变体1株。鉴定T1代突变体发现，CRISPR/Cas9系统敲除SNAC4/9后的番茄突变体可稳定遗传。敲除SNAC4/9基因在不同程度上影响了种子形态、植株生长发育和果实成熟，暗示SNAC4和SNAC9可能从不同的路径调控番茄果实成熟。