油橄榄叶提取物对Botrytis cinerea抑菌效果与机理研究

田立鹏 万强贵 王 婷 李春爱 蔡 梦 蒲陆梅

（甘肃农业大学理学院，甘肃兰州 730070）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）是核盘菌科孢盘菌属生物，是灰霉病的致病菌［1］。灰葡萄孢分布广泛，由其引起的粮食损害成本达数百亿甚至千亿美元，是威胁粮食安全的病原体之一［2］。目前，噻苯咪唑、苯基吡咯、苯菌灵和咯菌腈被广泛应用于灰霉病防治［3］，但化学杀菌剂含有有害成分，会导致产品中的副产物和其他活性物质积累，对环境和人体健康产生不良影响［4］，也会增加病原体对杀真菌剂的抗性，因此，寻找可以替代化学杀菌剂的抑菌物质具有重要意义。

油橄榄（Olea europaea）属于木犀科木犀榄属，原产于地中海，在非洲和亚洲地区分布广泛［5］。每年在修剪橄榄树的过程中会产生大量的橄榄叶副产物。油橄榄叶提取物富含羟基酪醇、橄榄苦苷、木樨草苷、咖啡酸和芦丁等多种酚类及黄酮类化合物［6］，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒［7］、降压、抗高血糖、抗动脉粥样硬化、降胆固醇作用［8］。近年来，关于天然提取物在抑菌和水果保鲜方面应用的研究较多，如孔维宝等［9］研究证明了油橄榄叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等8种致病菌具有较强的抑菌活性，且病原菌对提取物的敏感程度存在较大差异；Carla等［10］发现芳香植物月桂油及其提取物成分具有抗菌特性，富含抗氧化剂和其他活性物质；Khalifa等［11］将油橄榄叶及果渣提取物添加到壳聚糖保鲜膜中，有效抑制了扩展青霉和匍枝根霉的生长繁殖，降低了苹果和草莓的腐烂率。但现有研究主要集中在油橄榄叶提取物或提取物中单一成分的抗氧化性、抗菌性，而对提取物成分组成的分析不足，且有关油橄榄叶提取物对真菌抑制活性的研究还鲜有报道。

本试验以灰葡萄孢为对象，基于抑菌浓度、菌落直径、孢子抑制率等指标测定，研究了油橄榄叶提取物对灰葡萄孢生长的抑制作用，并通过细胞膜通透性、丙二醛含量以及活性氧代谢等方面，进一步探讨其抑菌作用的机理，以期为油橄榄叶提取物作为天然植物来源杀菌剂在果蔬采后病害控制中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜油橄榄叶（含水量42.5%），于2020年5月采自甘肃省陇南市祥宇油橄榄开发有限责任公司生态产业园，品种为莱星；灰葡萄孢（B.cinerea），甘肃农业大学食品科学与工程学院实验室保存菌种；无水乙醇（分析纯），无锡晶科化工有限公司；乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、硫代巴比妥酸、三氯乙酸，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；超氧阴离子、过氧化氢试剂盒，上海源叶科技有限公司；还原型辅酶Ⅱ氧化酶、谷胱甘肽还原酶、抗坏血酸过氧化物酶试剂盒，南京建成生物科技有限公司；过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶试剂盒，上海优选生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-2000B旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；JC-UT2000型紫外可见分光光度计，北京通用仪器有限公司；MF53-N型倒置荧光显微镜，广州市明美光电技术有限公司；JY92-IIN超声波细胞破碎仪，上海叶拓科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物制备参照王玉等［12］的方法，将新鲜的油橄榄叶自然风干，分别用蒸馏水、50%、70%、90%乙醇溶液按料液比1∶10（g/mL）浸泡1 h。然后在80℃条件下回流1 h，重复提取2次，合并滤液，减压蒸馏回收溶剂后，冷冻干燥，得到油橄榄叶提取物（含水量分别为4.09%、3.61%、1.97%、1.26%），存于4℃冰箱备用。

1.3.2 提取物成分分析总多酚含量（以干基计）的测定参照王晓杰等［13］的方法，气相色谱-质谱分析参照高歌等［14］的方法。

1.3.3 最低抑菌浓度的测定参照刘萍等［15］的方法并稍作修改，分别配制浓度为10.00、5.000、2.500、1.250、0.625 0、0.312 5 mg·mL-1的提取物溶液，于灭菌后的96孔板每孔依次加入20µL（1×106CFU·mL-1）菌悬液、90µL液体培养基以及提取物溶液，以无菌水为对照，置于23℃培养箱培养24 h，每孔取100 µL涂布于平板，培养12 h，以第一个出现单菌落平板的样品浓度作为最低抑菌浓度。

1.3.4 病斑菌落直径的测定经油橄榄叶提取物处理，浓度见表1，通过十字交叉法测定灰葡萄孢菌落生长直径［16］，以蒸馏水处理为空白对照，记为CK。

1.3.5 菌丝干重的测定经油橄榄叶提取物处理，浓度见表1，配制1×106CFU·mL-1的菌悬液，以无菌水处理组为对照，取10µL菌悬液加入100 mL液体培养基中振荡培养3 d，抽滤，收集菌丝，在80℃下烘干至恒重，测定菌丝干重。

1.3.6 孢子细胞膜完整性参考Zhang等［17］的方法，经油橄榄叶提取物处理，浓度见表1，配制1×106CFU·mL-1的菌悬液，以无菌水处理组为对照，将20µL菌悬液滴至载玻片中央，将碘化丙啶染色液滴于菌悬液中，再放入23℃培养箱中固定15 min后，在盖玻片一端滴无菌水并用吸水纸放于盖玻片另一侧将染色液洗净，在荧光显微镜20倍镜头下观察并拍照。

1.3.7B.cinerea电导率变化率的测定采用武淑娟等［18］的方法并稍作修改，经油橄榄叶提取物处理，浓度见表1，配制1×106CFU·mL-1的菌悬液，以无菌水处理组为对照，于4℃、8 000 r·min-1条件下离心5 min，取沉淀悬浮于20 mL蒸馏水中，分别于25、98℃环境下孵育30、15 min测定电导率，分别记为A1、A2。按公式（1）计算电导率变化率：

1.3.8 细胞内容物泄漏量的测定参照Paul等［19］的方法并稍作修改，经油橄榄叶提取物处理，浓度见表1，配制1×106CFU·mL-1的菌悬液，以无菌水处理组为对照，准确移取8 mL菌悬液，于4℃、8 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，分别测定260和280 nm下的吸光度OD280和OD260，蛋白质泄漏量以OD280表示，核酸泄漏量以OD260表示。

1.3.9 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定参照张蕊［20］的方法，经油橄榄叶提取物处理，浓度见表1，配制1×106CFU·mL-1的菌悬液，以无菌水处理组为对照，取10 µL菌悬液加入100 mL液体培养基中，（23±0.5）℃振荡培养3 d，抽滤，收集菌丝，菌丝中加入预冷的25 mL 0.1 mol·L-1pH值为7.8的磷酸钾缓冲溶液，磷酸钾缓冲溶液由1 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和2%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）配制而成，使用细胞破碎仪破碎3 min，离心取上清液，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），混匀后在沸水浴反应30 min，冷却离心取上清液，分别测定532和600 nm下的吸光度，记作OD532、OD600，并按照公式（2）计算MDA含量：

式中，A为反应液体积，mL；V为提取液体积，mL；α为测定提取液的体积，mL；w为材料鲜重，g；消光系数为155 mmol·L-1·cm-1。

1.3.10 活性氧代谢相关酶活性的测定NADH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）、抗 坏 血 酸 过 氧 化 物 酶（ascorbate peroxides，APX）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性及超氧阴离子（O·-2）、过氧化氢（H2O2）含量均按照试剂盒方法测定。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2016统计处理数据，并计算平均值与标准偏差，SPSS 19.0软件进行相关性和显著性分析，用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂对油橄榄叶提取物中总多酚的影响

由图1可知，在一定的乙醇浓度范围内（50%～90%），随着乙醇体积分数的增大，溶液中的总多酚含量显著升高，90%乙醇的提取效率显著高于其他溶剂（P<0.05）。乙醇/水溶液溶剂系统总多酚提取效率优于单一的水相溶剂，主要是因为乙醇/水溶液溶剂系统可以破坏多酚类物质与多糖等其他物质的结合键，有利于总多酚的提取［21］。

图1 不同溶剂提取物中的总多酚含量Fig.1 Total polyphenol content in different solvent extracts

2.2 不同溶剂提取物的气相色谱-质谱分析

甘肃农业大学理学院蒲陆梅团队前期研究表明，油橄榄叶提取物中存在的酚类化合物是提取物具有抗氧化活性和抑菌活性的主要原因［22］。固相微萃取和气相色谱-质谱联用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）分析结果（图2）表明，水、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇提取物均鉴定出7种类型的化合物：酚类、烃类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类，其中酚类、烃类、醇类、醛类为主要物质，相对含量明显高于酮类、酸类和酯类。且90%乙醇提取物中酚类物质相对含量最高，达到29.34%，水、50%乙醇、70%乙醇提取物中酚类物质的相对含量在9.36%～23.87%之间，主要成分为2，6-二叔丁基对甲酚、2，4-二叔丁基苯酚，上述结果差异是由酚类物质的主要成分在乙醇相和水相中溶解度不同所致。

图2 不同溶剂提取物中主要化合物的相对含量Fig.2 Comparative content of main compounds in different solvent extracts

2.3 提取物的抑菌性能

2.3.1 提取物的最低抑菌浓度以最低抑菌浓度的提取物处理B.cinerea后，结果表明B.cinerea的生长受到了抑制，如表1所示，70%、90%乙醇提取物相较于其他提取物抑菌效果更好，其中灰葡萄孢对90%乙醇提取物最敏感，其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值最小，为1.25 mg·mL-1，说明醇提物对灰葡萄孢具有较强的抗菌活性。

表1 不同溶剂提取物对B.cinerea的最低抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentration of different solvent extracts against B.cinerea /（mg·mL-1）

2.3.2 提取物对B.cinerea菌落直径的影响由图3可知，提取物（浓度均为对应的最低抑菌浓度）处理B.cinerea后，与对照相比，处理组灰葡萄孢菌落直径降低（P<0.05），且菌落直径随着提取溶剂乙醇体积分数的增大而减小，其中70%乙醇、90%乙醇提取物抑菌效果较佳。

图3 不同溶剂提取物对B.cinerea菌落直径的影响Fig.3 Effect of different solvent extracts on colony diameter of B.cinerea

2.3.3 提取物对B.cinerea菌丝干重的影响由图4可知，不同溶剂提取物处理B.cinerea后，菌丝干重随着提取溶剂乙醇体积分数的增大而减小，且70%乙醇、90%乙醇提取物处理后的菌丝干重显著降低（P<0.05），分别为对照的18.83%和8.91%，表明不同溶剂提取物处理后，能够有效抑制B.cinerea生物量的积累。

图4 不同溶剂提取物对菌丝干重的影响Fig.4 Effects of different solvent extracts on dry weight of mycelium

2.4 提取物对B.cinerea细胞膜完整性的影响

碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，能够用来验证细胞膜是否受损，其荧光强度越强，表明细胞的破损越严重，若能在荧光显微镜下观察到红色荧光，说明细胞质膜不完整［23］。由图5可知，随着提取溶剂乙醇体积分数的增大，处理组中被PI染色的孢子数逐渐增多，且90%乙醇提取物处理后染色的孢子数显著高于其他处理组（P<0.05）。处理组可观察到明显荧光，而对照组几乎无光。由此说明提取物处理破坏了B.cinerea细胞膜的完整性。

图5 不同溶剂提取物处理对B.cinerea细胞膜完整性的影响Fig.5 Effect of different solvent extracts on cell membrane integrity of B.cinerea

2.5 提取物对B.cinerea细胞膜通透性的影响

2.5.1 提取物对B.cinerea电导率变化率的影响由图6可知，不同溶剂提取物处理B.cinerea后，处理组的电导率变化率均显著高于对照组，且90%乙醇提取物处理后的电导率变化率最大，达到对照的3倍，表明不同溶剂提取物处理可提高B.cinerea细胞膜的电导率，破坏细胞膜的选择通透性，导致内容物外渗，由此说明细胞膜是提取物的作用靶点之一［24］。

图6 不同溶剂提取物对B.cinerea电导率变化率的影响Fig.6 Effect of different solvent extracts on the change rate of electrical conductivity in B.cinerea

2.5.2 提取物对B.cinerea内容物泄露的影响在菌体细胞遭受外界胁迫时，蛋白质和核酸泄漏量的增加是细胞膜受损的表现之一。不同溶剂提取物处理后，与对照相比，蛋白质（图7-A）和核酸泄漏量（图7-B）均有升高，且随提取溶剂乙醇体积分数的增大而增加，其中90%乙醇提取物处理后蛋白质和核酸泄漏量分别为对照的1.63倍和1.94倍（P<0.05）。上述结果表明，不同溶剂提取物处理导致B.cinerea孢子的细胞膜受损，细胞内蛋白质和核酸发生泄露。

图7 不同溶剂提取物对B.cinerea蛋白质、核酸泄漏量的影响Fig.7 Effects of different solvent extracts on protein and nucleic acid leakage in B.cinerea

2.5.3 提取物对B.cinereaMDA含量的影响丙二醛含量是反映机体抗氧化潜在能力的参数，可表征组织过氧化的损伤程度［25］。由图8可知，不同溶剂提取物处理后，MDA含量随着提取溶剂乙醇体积分数的增大而增加，其中70%乙醇、90%乙醇提取物处理后的MDA含量较CK组显著升高，说明细胞膜的脂质氧化严重。上述结果表明，70%乙醇、90%乙醇提取物处理能够显著引起细胞膜脂质过氧化，且提取溶剂乙醇体积分数越大，MDA含量越高，从而导致B.cinerea细胞膜损伤越严重。

图8 不同溶剂提取物对B.cinerea MDA含量的影响Fig.8 Effects of different solvent extracts on MDA content in B.cinerea

2.6 提取物对B.cinerea活性氧代谢的影响

2.6.1 提取物对B.cinerea活性氧代谢相关酶活性的影响活性氧（reactive oxygen species，ROS）代谢过程中的相关酶活性是衡量活性氧产生或清除的重要指标。由图9可知，经提取物处理后，处理组B.cinerea的NOX、CAT、POD活性显著高于对照组，且随着提取溶剂乙醇体积分数的增大呈现升高的趋势，其中90%乙醇提取物处理后酶活较CK组的变化率最大，NOX、CAT、POD活性分别为对照组的1.8、7、8倍。SOD、GR、APX活性在经过提取物处理后呈现降低的趋势。

图9 不同溶剂提取物对B.cinerea ROS代谢相关酶活性的影响Fig.9 Effect of solvent extract on the activity of ROS metabolism related enzymes in B.cinerea

2.6.2 提取物对B.cinerea活性氧代谢的影响ROS是细胞内具有化学反应活性的氧代谢产物，主要以氧化过程形成的超氧阴离子形式存在。由图10-A可知，油橄榄叶提取物处理B.cinerea后，O·-2含量随着提取溶剂乙醇体积分数的增大呈现升高的趋势，90%乙醇提取物处理最高，达到了对照组的11倍，且处理组的O·-2含量显著高于对照组（P<0.05），说明油橄榄叶提取物处理促进了胞内ROS的积累。

由图10-B可知，油橄榄叶提取物处理B.cinerea后，处理组的H2O2含量显著高于对照组，表明提取物处理增强了B.cinerea的胞内抗氧化能力。

图10 不同溶剂提取物对B.cinerea O·-2、H2O2含量的影响Fig.10 Effects of different solvent extracts on O·-2 and H2O2contents of B.cinerea

3 讨论

油橄榄叶提取物富含酚类物质，能够有效抑制病原菌的生长［6］，本研究结果表明，总多酚含量较高的提取物对B.cinerea菌体具有更佳的抑菌效果。经油橄榄叶提取物处理能够抑制B.cinerea菌落直径的扩大，降低菌丝生物量的积累，这与Khalifa等［11］的研究结论一致。

细胞膜对生物体的生长与繁殖起着重要的作用，MDA是细胞膜脂质过氧化的产物之一，可以反映组织过氧化损伤程度［25］。本试验发现，经油橄榄叶提取物处理后，B.cinerea的细胞膜受损，且处理组的电导率变化率、内容物泄露量及MDA含量均升高，说明油橄榄叶提取物处理能够加速膜脂质过氧化发生，造成细胞膜结构的降解和损伤，该结果与武淑娟等［18］对粉红单端孢细胞膜结构的研究结论一致。

Ge等［26］研究发现，NOX、CAT、SOD、POD是抗氧化系统中主要的抗氧化酶。SOD可以通过歧化反应将超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2［27-28］。有研究表明，可以通过提高NOX、CAT、POD的活性来促进H2O2和O·-2的产生，从而抑制粉红单端孢［18］、硫色镰刀菌［20］等的生长。抗氧化酶有助于减少应激条件下ROS的产生和过量积累［29］。Hasanuzzaman等［30］研究发现，APX、脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）、GR等酶相互协作，有助于减少ROS的积累、降低H2O2含量并维持氧化还原稳态。

本试验结果发现，经油橄榄叶提取物处理后，与对照组相比，NOX、CAT、POD活性均呈现上升的趋势，但SOD、GR、APX的活性显著降低，O·-2和H2O2含量在以上酶的相互协调作用下处于较高水平，致使细胞内部活性氧积累增加，破坏了机体的活性氧代谢平衡，进而加剧了菌体的死亡凋零，抑制了菌体的生长。但本研究仅在体外试验探究了油橄榄叶提取物对B.cinerea菌体生长及细胞膜的影响，因此，后续还需对油橄榄叶提取物对B.cinerea的作用机制在果实体内进行进一步的验证。

4 结论

B.cinerea菌体对油橄榄叶90%乙醇提取物有较强的敏感性，90%乙醇提取物（1.25 mg·mL-1）处理破坏了B.cinerea菌体细胞膜的完整性，提高了电导率变化率，增加了细胞内容物泄露量，并促进了MDA含量的积累，从而加剧了细胞膜的损伤程度，诱导机体内ROS相关酶活性的变化，破坏了活性氧代谢平衡，使菌体的生长受到抑制。本试验揭示了油橄榄叶提取物对B.cinerea的抑制作用及机理，为油橄榄叶提取物作为天然植物来源杀菌剂提供了理论依据。