克氏原螯虾白斑综合征病毒研究进展

程保政，王顺昌

(1.淮南市水产技术推广站，安徽 淮南 232007；2.淮南师范学院，安徽 淮南 232038)

自2003 年以来，我国已经成为世界头号克氏原螯虾生产国和消费国。随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加，各类病害的传播速度也迅速增加，“五月瘟”等暴发性疾病的发生给主产区产业的发展带来很大威胁(Shen G 等，2020)。克氏原螯虾的主要病原体包括螺原体、弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、真菌和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)等，其中WSSV 因具有传播速度快、死亡率高和防治困难等特点，给克氏原螯虾等甲壳类养殖业带来很大损失。

一、WSSV的发现和结构特征

1.WSSV 的发现 1992 年，白斑综合征病毒首次发现于我国台湾省对虾池内，造成大规模对虾死亡(Chou H Y 等，1995)；1993 年由井上等人从暴发疾病的对虾体内观察到病毒颗粒，1993年5月至8 月，我国从南向北陆续暴发对虾白斑综合征，导致我国对虾减产80%(Zhan W B 等，1998)，到2005 年，对虾白斑综合征已经扩散至全球主要养殖国家，1996 年，该病毒被命名为白斑综合征病毒(Escobedo-Bonilla C M 等，2008)。WSSV 发现于对虾科(Penaeid)虾类，但很快扩散至其他养殖甲壳类动物，如蟹、螯虾等，到2002 年，WSSV 已经广布于养殖和天然水域众多甲壳类动物体内。由于WSSV 几乎可以感染所有的养殖甲壳类，已经成为对全球虾蟹类养殖威胁最严重的病毒(Shekhar M S等，2015)。

2.WSSV 的分子特征 WSSV 是一种无包涵体的杆状包膜病毒，长210～380 纳米、宽70～167 纳米，属于大型无脊椎动物病毒。WSSV为双链DNA病毒，基因组大小约300 kb。目前，已经测定了多个病毒株的基因组全序列，如中国大陆株、中国台湾株、泰国株和澳大利亚株等。WSSV 基因组编码约184 个蛋白，但目前只有约30%的编码蛋白的功能得到了注释。在已经注释的38 种WSSV 结构蛋白中，有21 种位于被膜、10 种位于核衣壳、5 种位于衣壳外被(Escobedo- Bonilla C M 等，2008)。活体实验显示，位于外被的VP28蛋白与病毒的入侵密切相关，利用VP28 多克隆抗血清处理可以显著降低死亡率。克氏原螯虾实验显示，包膜蛋白VP31、VP33 和衣壳外被蛋白VP36A 中和抗体能够显著降低机体的感染率，发挥保护作用，这一结果显示，WSSV 的结构蛋白可以作为重要的免疫靶标(van Hulten等，2001)。

二、WSSV的检测、病理学特征和传播

1.WSSV 的检测方法 迄今为止，已经有多种检测方法应用于各类研究，如酶联免疫吸附法(ELISA)、原位杂交、透射电镜观察、套式PCR 和实时荧光定量PCR法等。全国水产标准化技术委员会于2012 年提出了白斑综合征诊断标准，包括《白斑综合征(WSD)诊断规程 第1部分：核酸探针斑点杂交检测法》(GB/T 28630.1-2012)、《白斑综合征(WSD)诊断规程 第2 部分：套式PCR 检测法》(GB/T 28630.2-2012)、《白斑综合征(WSD)诊断规程 第3 部分：原位杂交检测法》(GB/T 28630.3-2012)、《白斑综合征(WSD)诊断规程第4 部分：组织病理学诊断法》(GB/T 28630.4-2012)和《白斑综合征(WSD)诊断规程 第5 部分：新鲜组织的T-E 染色法》(GB/T 28630.5-2012)等，其中套式PCR法灵敏度高、成本低廉，是世界动物卫生组织推荐的监测方法。

2.WSSV感染的病理学特征 利用套式PCR检测发现，WSSV 广泛分布于机体的各个器官，如体表、附肢、肝胰脏、鳃和血淋巴等(Escobedo-Bonilla C M 等，2008)。在外观症状上，感染WSSV 的对虾均在外壳显现出直径0.5～3.0 毫米的白色斑点，但目前斑点形成的确切机制尚不清楚，Wang Y G 等(1999)推测WSSV 感染损伤了外表皮，导致钙离子在甲壳内沉积，从而形成白色斑点。克氏原螯虾感染病毒后甲壳并不呈现出白色斑点，组织学分析发现，感染WSSV 的克氏原螯虾呈现出肝细胞、鳃细胞肿大和坏死等病理学特征。苏木精伊红染色显示，感染WSSV 的细胞核膨大和染色质边缘化，并具有典型的伊红染色深的包涵体(何琦瑶等，2018)。流行病调查显示，感染WSSV 的克氏原螯虾活力下降、反应迟钝、摄食率显著降低，常常静卧于池边；解剖研究发现，患病特别是濒死个体肝胰脏褪色、表皮肿胀而易与甲壳分离、血淋巴凝固能力下降等(Shi Z 等，2005)；肠道菌群分析显示，感染WSSV的克氏原螯虾肠道气单胞菌属、黄杆菌属等潜在致病菌丰度显著增加，这也可能是导致虾死亡的重要原因(陈一铭等，2020)。

3.国内WSSV流行情况 2006年WSSV首次暴发于浙江舟山养殖的克氏原螯虾(王忠发等，2007)，自此以后，WSSV便在我国克氏原螯虾主养区流行，并成为主要的死亡因素。根据潘子豪(2013)报道，安徽省自2008 年以来，多地发生克氏原螯虾规模性死亡，经巢式PCR分析鉴定，该疾病的病原体为WSSV。湖北省是我国最大的克氏原螯虾产区，也是克氏原螯虾WSSV 的高发地区，WSSV 阳性检出率在40%～65%，这一发病率与国外报道的发病率基本一致(李青彬等，2019)。陈红莲等(2020)采样分析发现，在安徽省克氏原螯虾主养区，稻田养殖克氏原螯虾WSSV 的检出率高达98.3%，但天然水域检出率不到10%，表明高密度养殖是造成WSSV 传播的重要因素。到目前为止，国内所有克氏原螯虾主养区均存在WSSV 的流行和传播，天然水域WSSV 检出率也逐渐提高，并且可能存在与其他病毒交互作用等情况。

三、机体免疫系统和环境因素的影响

1.免疫系统对WSSV 感染的反应 克氏原螯虾对病原体的反应来自于先天免疫机制，从构成上看，克氏原螯虾先天免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两个部分，其中细胞免疫依赖于血细胞识别和吞噬病原体，体液免疫主要依赖于酚氧化酶和凝集素系统等(Huang Y等，2020)。酚氧化酶是甲壳类先天免疫系统的重要组成部分，通过黑化反应抵抗病原体侵袭。利用qRT-PCR技术发现，克氏原螯虾感染WSSV 后，肝胰脏和血细胞酚氧化酶的表达显著上调(Yi S等，2017)。

2.克氏原螯虾感染WSSV 的信号传递 机体对病原体的反应依赖于一系列保守的信号传导途径，目前的研究发现，Toll 途径、JAK-STAT 途径和PI3K-AKT 途径等在克氏原螯虾应答WSSV 感染中具有重要功能(Liu L K等，2021)。Toll信号途径是无脊椎动物的关键免疫反应分子，到目前为止，已经在克氏原螯虾鉴定出4 个Toll 受体，其中PcToll5 和PcToll6 参与调控抗脂多糖因子(ALF)的表达，而感染WSSV 后，克氏原螯虾PcALF2 和PcALF3 显著上调，并具有显著的时间效应，参与了机体对WSSV 的防御机制(Huang Y 等，2018)。JAK-STAT途径在进化上高度保守，参与了脊椎动物和无脊椎动物的抗病毒反应。已经鉴定出克氏原螯虾的3 个JAK-STAT 基因，在WSSV 感染时，呈现出显著的差异性表达。Chen H 等(2021)对感染WSSV 3 小时的克氏原螯虾肠道转录组学研究，共筛选出7 000 个差分表达基因，可归属为250 个KEGG 通路，其中有28 个通路具有极其显著性差异表达(P＜0.01)，利用qRT-PCR 对JAK-STAT途径定量分析发现，其中21 个基因表达显著上调、2 个基因表达显著下调。利用基于iTRAQ 技术的蛋白组学研究发现，感染WSSV 后，克氏原螯虾血细胞与吞噬作用、细胞凋亡以及一系列蛋白酶的活性显著上调(Zhou X等，2021)。

3.养殖环境对WSSV 的影响 WSSV 的暴发是病毒、宿主和环境因素综合作用的结果，养殖水温是最重要的环境因子。蓝海琴等(2021)通过采集不同地区和不同季节的克氏原螯虾样本分析发现，克氏原螯虾WSSV 检出率极低，在水温20～26℃下，WSSV 阳性率达60%以上，当水温升高至26℃以上时，WSSV 的检出率显著降低。人工感染实验显示，在19℃水温下时，克氏原螯虾死亡率为(23.51±0.84)%，当水温升高至25℃时，感染后死亡率达到100%，但当水温升高至32℃时，感染后死亡率降低至(38.42±1.21)%。进一步的分析发现，低温不利于WSSV 的增殖，而高温有助于激活机体的先天免疫分子，如抗菌蛋白2、酚氧化酶和热休克蛋白70等(Jiang N等，2019)。由此可见，养殖水温对WSSV 的传播、致死率等有着关键的影响。阿特拉津是常用除草剂，同时也是潜在的内分泌干扰物，阿特拉津暴露可导致克氏原螯虾总血细胞计数下降、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性等先天免疫参数显著下降，增加了感染WSSV 的死亡率(Yang H 等，2021)。此外，一些研究显示，环境高水平氨氮、亚硝酸氮等均可加速感染WSSV 的克氏原螯虾死亡，而在弱碱性环境条件下，WSSV在克氏原螯虾体内的增殖速率最低(郝晨光，2020)。由此可见，在当前缺乏有效药物进行防治的条件下，改善养殖环境是应对WSSV 感染的有效手段。

四、克氏原螯虾WSSV防治技术研究

2005年，武汉大学基于WSSV包膜蛋白VP28和VP19 开发的多克隆抗体，在15～22℃下，对感染病毒的克氏原螯虾保护率可达100%，在26℃下，对感染的保护率达到65%(袁军法等，2005)。以50毫克/千克比例在饲料中添加阿昔洛韦，可有效抑制WSSV 的复制，克氏原螯虾感染WSSV 后的成活率提高至56%(Liang C S 等，2021)。目前对于克氏原螯虾WSSV 的防治研究多集中在如何激发机体先天免疫系统活性，从而使机体获得抵抗WSSV 的能力。人们使用了各类免疫佐剂、免疫增效剂、天然产物、微生物制剂等，均取得一定效果。橙皮素是存在于柑橘属植物幼果中的天然黄酮类化合物，Qian X等(2019)研究发现，以50毫克/千克剂量添加于饵料中，可有效降低人工感染WSSV 后的死亡率，进一步研究发现，橙皮素显著上调了总血细胞计数、酚氧化酶和超氧化物歧化酶3个关键先天免疫参数的活性。利用微生物的拮抗作用，可降低WSSV感染的死亡率，Lai Y等(2020)在饲料中添加5 克/千克的解淀粉芽孢杆菌饲喂克氏原螯虾，在感染WSSV 168小时后，依然有超过40%个体存活，而对照组在感染156 小时后就全部死亡。进一步分析发现，解淀粉芽孢杆菌饲料补充增加了Toll 受体、NF-κB 和C 型凝集素等关键先天免疫分子的表达。研究显示，通过饲料补充壳聚糖、紫云英多糖或壳寡糖等，均可显著提高克氏原螯虾的先天免疫能力，增强其对白斑病毒等病原体的抵抗力(Cheng Y，2019)。

这些结果显示，在饲料中添加免疫增强剂或微生态制剂，为防治WSSV 提供了新思路，但至目前尚没有筛选出任何低成本有效治疗药物，也没有选育出抗WSSV 克氏原螯虾新品种。因此，在生产上，除了改善养殖环境、合理调配养殖季节与上市时间等措施外，尚缺乏根本性的有效手段。