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克氏原螯虾白斑综合征病毒研究进展

2023-01-15程保政王顺昌

科学养鱼 2022年7期
关键词:白斑对虾克氏

程保政,王顺昌

(1.淮南市水产技术推广站,安徽 淮南 232007;2.淮南师范学院,安徽 淮南 232038)

自2003 年以来,我国已经成为世界头号克氏原螯虾生产国和消费国。随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加,各类病害的传播速度也迅速增加,“五月瘟”等暴发性疾病的发生给主产区产业的发展带来很大威胁(Shen G 等,2020)。克氏原螯虾的主要病原体包括螺原体、弧菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、真菌和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)等,其中WSSV 因具有传播速度快、死亡率高和防治困难等特点,给克氏原螯虾等甲壳类养殖业带来很大损失。

一、WSSV的发现和结构特征

1.WSSV 的发现 1992 年,白斑综合征病毒首次发现于我国台湾省对虾池内,造成大规模对虾死亡(Chou H Y 等,1995);1993 年由井上等人从暴发疾病的对虾体内观察到病毒颗粒,1993年5月至8 月,我国从南向北陆续暴发对虾白斑综合征,导致我国对虾减产80%(Zhan W B 等,1998),到2005 年,对虾白斑综合征已经扩散至全球主要养殖国家,1996 年,该病毒被命名为白斑综合征病毒(Escobedo-Bonilla C M 等,2008)。WSSV 发现于对虾科(Penaeid)虾类,但很快扩散至其他养殖甲壳类动物,如蟹、螯虾等,到2002 年,WSSV 已经广布于养殖和天然水域众多甲壳类动物体内。由于WSSV 几乎可以感染所有的养殖甲壳类,已经成为对全球虾蟹类养殖威胁最严重的病毒(Shekhar M S等,2015)。

2.WSSV 的分子特征 WSSV 是一种无包涵体的杆状包膜病毒,长210~380 纳米、宽70~167 纳米,属于大型无脊椎动物病毒。WSSV为双链DNA病毒,基因组大小约300 kb。目前,已经测定了多个病毒株的基因组全序列,如中国大陆株、中国台湾株、泰国株和澳大利亚株等。WSSV 基因组编码约184 个蛋白,但目前只有约30%的编码蛋白的功能得到了注释。在已经注释的38 种WSSV 结构蛋白中,有21 种位于被膜、10 种位于核衣壳、5 种位于衣壳外被(Escobedo- Bonilla C M 等,2008)。活体实验显示,位于外被的VP28蛋白与病毒的入侵密切相关,利用VP28 多克隆抗血清处理可以显著降低死亡率。克氏原螯虾实验显示,包膜蛋白VP31、VP33 和衣壳外被蛋白VP36A 中和抗体能够显著降低机体的感染率,发挥保护作用,这一结果显示,WSSV 的结构蛋白可以作为重要的免疫靶标(van Hulten等,2001)。

二、WSSV的检测、病理学特征和传播

1.WSSV 的检测方法 迄今为止,已经有多种检测方法应用于各类研究,如酶联免疫吸附法(ELISA)、原位杂交、透射电镜观察、套式PCR 和实时荧光定量PCR法等。全国水产标准化技术委员会于2012 年提出了白斑综合征诊断标准,包括《白斑综合征(WSD)诊断规程 第1部分:核酸探针斑点杂交检测法》(GB/T 28630.1-2012)、《白斑综合征(WSD)诊断规程 第2 部分:套式PCR 检测法》(GB/T 28630.2-2012)、《白斑综合征(WSD)诊断规程 第3 部分:原位杂交检测法》(GB/T 28630.3-2012)、《白斑综合征(WSD)诊断规程第4 部分:组织病理学诊断法》(GB/T 28630.4-2012)和《白斑综合征(WSD)诊断规程 第5 部分:新鲜组织的T-E 染色法》(GB/T 28630.5-2012)等,其中套式PCR法灵敏度高、成本低廉,是世界动物卫生组织推荐的监测方法。

2.WSSV感染的病理学特征 利用套式PCR检测发现,WSSV 广泛分布于机体的各个器官,如体表、附肢、肝胰脏、鳃和血淋巴等(Escobedo-Bonilla C M 等,2008)。在外观症状上,感染WSSV 的对虾均在外壳显现出直径0.5~3.0 毫米的白色斑点,但目前斑点形成的确切机制尚不清楚,Wang Y G 等(1999)推测WSSV 感染损伤了外表皮,导致钙离子在甲壳内沉积,从而形成白色斑点。克氏原螯虾感染病毒后甲壳并不呈现出白色斑点,组织学分析发现,感染WSSV 的克氏原螯虾呈现出肝细胞、鳃细胞肿大和坏死等病理学特征。苏木精伊红染色显示,感染WSSV 的细胞核膨大和染色质边缘化,并具有典型的伊红染色深的包涵体(何琦瑶等,2018)。流行病调查显示,感染WSSV 的克氏原螯虾活力下降、反应迟钝、摄食率显著降低,常常静卧于池边;解剖研究发现,患病特别是濒死个体肝胰脏褪色、表皮肿胀而易与甲壳分离、血淋巴凝固能力下降等(Shi Z 等,2005);肠道菌群分析显示,感染WSSV的克氏原螯虾肠道气单胞菌属、黄杆菌属等潜在致病菌丰度显著增加,这也可能是导致虾死亡的重要原因(陈一铭等,2020)。

3.国内WSSV流行情况 2006年WSSV首次暴发于浙江舟山养殖的克氏原螯虾(王忠发等,2007),自此以后,WSSV便在我国克氏原螯虾主养区流行,并成为主要的死亡因素。根据潘子豪(2013)报道,安徽省自2008 年以来,多地发生克氏原螯虾规模性死亡,经巢式PCR分析鉴定,该疾病的病原体为WSSV。湖北省是我国最大的克氏原螯虾产区,也是克氏原螯虾WSSV 的高发地区,WSSV 阳性检出率在40%~65%,这一发病率与国外报道的发病率基本一致(李青彬等,2019)。陈红莲等(2020)采样分析发现,在安徽省克氏原螯虾主养区,稻田养殖克氏原螯虾WSSV 的检出率高达98.3%,但天然水域检出率不到10%,表明高密度养殖是造成WSSV 传播的重要因素。到目前为止,国内所有克氏原螯虾主养区均存在WSSV 的流行和传播,天然水域WSSV 检出率也逐渐提高,并且可能存在与其他病毒交互作用等情况。

三、机体免疫系统和环境因素的影响

1.免疫系统对WSSV 感染的反应 克氏原螯虾对病原体的反应来自于先天免疫机制,从构成上看,克氏原螯虾先天免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两个部分,其中细胞免疫依赖于血细胞识别和吞噬病原体,体液免疫主要依赖于酚氧化酶和凝集素系统等(Huang Y等,2020)。酚氧化酶是甲壳类先天免疫系统的重要组成部分,通过黑化反应抵抗病原体侵袭。利用qRT-PCR技术发现,克氏原螯虾感染WSSV 后,肝胰脏和血细胞酚氧化酶的表达显著上调(Yi S等,2017)。

2.克氏原螯虾感染WSSV 的信号传递 机体对病原体的反应依赖于一系列保守的信号传导途径,目前的研究发现,Toll 途径、JAK-STAT 途径和PI3K-AKT 途径等在克氏原螯虾应答WSSV 感染中具有重要功能(Liu L K等,2021)。Toll信号途径是无脊椎动物的关键免疫反应分子,到目前为止,已经在克氏原螯虾鉴定出4 个Toll 受体,其中PcToll5 和PcToll6 参与调控抗脂多糖因子(ALF)的表达,而感染WSSV 后,克氏原螯虾PcALF2 和PcALF3 显著上调,并具有显著的时间效应,参与了机体对WSSV 的防御机制(Huang Y 等,2018)。JAK-STAT途径在进化上高度保守,参与了脊椎动物和无脊椎动物的抗病毒反应。已经鉴定出克氏原螯虾的3 个JAK-STAT 基因,在WSSV 感染时,呈现出显著的差异性表达。Chen H 等(2021)对感染WSSV 3 小时的克氏原螯虾肠道转录组学研究,共筛选出7 000 个差分表达基因,可归属为250 个KEGG 通路,其中有28 个通路具有极其显著性差异表达(P<0.01),利用qRT-PCR 对JAK-STAT途径定量分析发现,其中21 个基因表达显著上调、2 个基因表达显著下调。利用基于iTRAQ 技术的蛋白组学研究发现,感染WSSV 后,克氏原螯虾血细胞与吞噬作用、细胞凋亡以及一系列蛋白酶的活性显著上调(Zhou X等,2021)。

3.养殖环境对WSSV 的影响 WSSV 的暴发是病毒、宿主和环境因素综合作用的结果,养殖水温是最重要的环境因子。蓝海琴等(2021)通过采集不同地区和不同季节的克氏原螯虾样本分析发现,克氏原螯虾WSSV 检出率极低,在水温20~26℃下,WSSV 阳性率达60%以上,当水温升高至26℃以上时,WSSV 的检出率显著降低。人工感染实验显示,在19℃水温下时,克氏原螯虾死亡率为(23.51±0.84)%,当水温升高至25℃时,感染后死亡率达到100%,但当水温升高至32℃时,感染后死亡率降低至(38.42±1.21)%。进一步的分析发现,低温不利于WSSV 的增殖,而高温有助于激活机体的先天免疫分子,如抗菌蛋白2、酚氧化酶和热休克蛋白70等(Jiang N等,2019)。由此可见,养殖水温对WSSV 的传播、致死率等有着关键的影响。阿特拉津是常用除草剂,同时也是潜在的内分泌干扰物,阿特拉津暴露可导致克氏原螯虾总血细胞计数下降、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性等先天免疫参数显著下降,增加了感染WSSV 的死亡率(Yang H 等,2021)。此外,一些研究显示,环境高水平氨氮、亚硝酸氮等均可加速感染WSSV 的克氏原螯虾死亡,而在弱碱性环境条件下,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖速率最低(郝晨光,2020)。由此可见,在当前缺乏有效药物进行防治的条件下,改善养殖环境是应对WSSV 感染的有效手段。

四、克氏原螯虾WSSV防治技术研究

2005年,武汉大学基于WSSV包膜蛋白VP28和VP19 开发的多克隆抗体,在15~22℃下,对感染病毒的克氏原螯虾保护率可达100%,在26℃下,对感染的保护率达到65%(袁军法等,2005)。以50毫克/千克比例在饲料中添加阿昔洛韦,可有效抑制WSSV 的复制,克氏原螯虾感染WSSV 后的成活率提高至56%(Liang C S 等,2021)。目前对于克氏原螯虾WSSV 的防治研究多集中在如何激发机体先天免疫系统活性,从而使机体获得抵抗WSSV 的能力。人们使用了各类免疫佐剂、免疫增效剂、天然产物、微生物制剂等,均取得一定效果。橙皮素是存在于柑橘属植物幼果中的天然黄酮类化合物,Qian X等(2019)研究发现,以50毫克/千克剂量添加于饵料中,可有效降低人工感染WSSV 后的死亡率,进一步研究发现,橙皮素显著上调了总血细胞计数、酚氧化酶和超氧化物歧化酶3个关键先天免疫参数的活性。利用微生物的拮抗作用,可降低WSSV感染的死亡率,Lai Y等(2020)在饲料中添加5 克/千克的解淀粉芽孢杆菌饲喂克氏原螯虾,在感染WSSV 168小时后,依然有超过40%个体存活,而对照组在感染156 小时后就全部死亡。进一步分析发现,解淀粉芽孢杆菌饲料补充增加了Toll 受体、NF-κB 和C 型凝集素等关键先天免疫分子的表达。研究显示,通过饲料补充壳聚糖、紫云英多糖或壳寡糖等,均可显著提高克氏原螯虾的先天免疫能力,增强其对白斑病毒等病原体的抵抗力(Cheng Y,2019)。

这些结果显示,在饲料中添加免疫增强剂或微生态制剂,为防治WSSV 提供了新思路,但至目前尚没有筛选出任何低成本有效治疗药物,也没有选育出抗WSSV 克氏原螯虾新品种。因此,在生产上,除了改善养殖环境、合理调配养殖季节与上市时间等措施外,尚缺乏根本性的有效手段。

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