两株微生物菌株对阿维菌素降解性能的研究

雒晓芳，徐开慧，王迎菲，王婉莹，许 瑾，张禹晗，陈丽华*

1西北民族大学实验教学部；2西北民族大学化工学院；3西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030

阿维菌素是一类典型的大环内酯类抗生素，常用作兽药在畜牧业中发挥重要作用。随着畜牧业的蓬勃发展，人类对抗生素的需求量也日益增加。目前我国每年生产使用抗生素约为18.9万吨，其中较大部分被应用于畜牧养殖业，其中兽药抗生素的使用量大约占到畜牧业使用抗生素总量的一半以上[1]。在2010年，我国的兽药原料和使用量超过日本和美国，成为世界第一兽药原料使用大国[2]。但大量使用的抗生素可能导致严重的后果，兽药抗生素进入生物体后一部分被吸收，而另一部分抗生素超出了受药牲畜的承受范围而被排出体内，借助迁移作用，抗生素随之转移到不同的生态系统中[3]，从而在水和土壤中不断累积，这会影响环境中生物的正常生命运转[4]。因此，高效简便地处理目前环境中残留的抗生素，防止其对生物造成进一步伤害成为了人们研究的热点。

目前抗生素的处理方法主要有物理吸附法、高级氧化法和微生物降解法[5]。由于人们环保意识不断加强，微生物降解法成为研究者青睐的技术[6]。现今，已报道的可降解阿维菌素的微生物主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[7]、不动杆菌(Acinetobacterlwoffi)[8]、志贺氏菌(Shigella)[9]、白腐真菌[10]等，它们通常利用新陈代谢作用产生的大环内酯类降解酶对阿维菌素进行降解，但大多数研究仅简单通过单因素实验研究微生物对阿维菌素的降解特性，没有利用正交法或响应面法进一步分析，无法准确得出最优降解条件。故本实验以阿维菌素为代表抗生素，利用高效液相色谱法[11]测得不同温度、pH、装样量、菌种液量、培养时间条件下枯草芽孢杆菌、志贺氏菌对阿维菌素的降解特性，并利用响应面法[12]分析降解特性以得到该微生物菌株降解阿维菌素的最佳条件，以期为微生物降解阿维菌素乃至其余兽药抗生素的实际应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

95%阿维菌素原药(成都华夏试剂厂，20190327)；无机盐培养基(NH4Cl 1.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蛋白胨0.2 g，蒸馏水定容至1 L，pH=7.0[13])；营养肉汤培养基(蛋白胨10 g、牛肉浸出粉3 g、氯化钠5 g、琼脂15 g，蒸馏水定容至1 L)；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；枯草芽孢杆菌、志贺氏菌(兰州市黄河段河水中分离筛选)。

1.2 仪器

Aglient1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；超净工作台(苏州智净净化设备有限公司)；高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；分析天平(梅特勒-托利多公司)。

1.3 标准曲线的绘制

1.3.1 液相色谱仪工作条件

选择测定波长244 nm、流动相为甲醇-水、流动相比例为95∶5、流量1 min/mL、柱温28 ℃、进样量10 μL。

1.3.2 标准曲线的绘制

称量100 mg阿维菌素，放入100 mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度线，配制成1 000 mg/L的阿维菌素母液，摇匀，放入冰箱备用。

分别移取阿维菌素母液加入无机盐培养基中稀释至20、40、60、80、100 mg/L。然后从不同浓度阿维菌素溶液中分别移取2 mL至试管中，加入4 mL乙腈及0.5 g NaCl，将试管于振荡器上振荡1 min，静置30 min[14]。取上层清液通过0.45 μm的滤膜过滤。用高效液相色谱仪测得其峰面积，根据结果绘制成标准曲线。

1.4 单因素实验设计

将温度、pH、装样量、菌种液量、培养时间作为影响因素，测得其对各菌株降解能力的影响，筛选出影响最显著的三组因素进行多因素实验。

菌种液的制备：通过无机盐培养基在50 mL三角瓶中以35 ℃、pH为7、120 r/min震荡通气条件下培养枯草芽孢杆菌和志贺氏菌。通过血细胞计数板计数，稀释菌种液的菌浓至约1×108CFU/mL

1.4.1 温度对降解性能的影响

根据一般细菌的生长温度范围为5～60 ℃，同时中性细菌的最适温度一般为37 ℃，设计温度梯度为25、30、35、40、45 ℃。固定实验条件装样量80 mL(250 mL三角瓶)、菌种液1 mL、pH 7.0、120 r/min震荡通气培养6 d，研究温度对微生物菌株降解阿维菌素的影响。

1.4.2 pH对降解性能的影响

根据本实验所用菌株最适pH范围均为7.2～7.6，设计pH梯度为5、6、7、8、9，通过向培养基中加入适量盐酸或氢氧化钠调节pH至所需值。固定实验条件温度35 ℃、装样量80 mL、菌种液1 mL、培养时间6 d，研究pH对微生物菌株降解阿维菌素的影响。

1.4.3 装样量对降解性能的影响

设计装样量梯度为40、60、80、100、120 mL，通过加入不同体积的无机盐培养基达到所需装样量。固定实验条件温度35 ℃、装样量80 mL、菌种液1 mL、培养时间6 d，研究pH对微生物菌株降解阿维菌素的影响。

1.4.4 菌种液量对降解性能的影响

设计菌种液量梯度为0.625%、1.25%、2.5%、3.75%、5%(加入适量营养肉汤培养基对菌种液量为1×108CFU/mL的菌悬浮液进行稀释以达到目标浓度)。固定实验条件温度35 ℃、装样量80 mL、培养时间6 d，研究菌种液量对微生物菌株降解阿维菌素的影响。

1.4.5 培养时间对降解性能的影响

设计培养时间梯度为1、2、3、4、5、6 d。固定实验条件温度35 ℃、装样量80 mL、菌种液量1.25%，研究培养时间对微生物菌株降解阿维菌素的影响。

1.5 多因素实验设计

根据单因素实验结果，将温度、装样量、菌种液量作为自变量，降解率为响应值，利用Design-Expert中的Box-Behnken 模块设计三因素三水平的响应面实验。每组实验重复3次。根据实验结果进行模型的建立及响应面分析。响应面设计因素与水平如表1、表2。

表1 枯草芽孢杆菌响应面优化设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization design of Bacillus subtilis

表2 志贺氏菌响应面优化设计因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface optimization design of Shigella

利用Design-Expert对阿维菌素的降解实验进行设计，可得出枯草芽孢杆菌及志贺氏菌对阿维菌素的理论最大降解率及此时的降解条件。将降解条件固定，利用最佳降解条件对阿维菌素进行降解，以验证优化后方案的准确性及可靠性。

2 结果与分析

2.1 标准曲线分析

由图1可知，阿维菌素标准曲线的R2=0.9973，说明在20～100 mg/L范围内该曲线线性关系良好，可用于实验数据分析。

图1 阿维菌素标准曲线Fig.1 Standard curve of avermectin

2.2 初筛实验结果分析

根据实验结果可知，在1 d的培养时间内，枯草芽孢杆菌对阿维菌素的降解率为(21.76±0.88)%，志贺氏菌对阿维菌素的降解率为(17.91±0.66)%，即说明分离筛选获得的两株细菌均有较好的阿维菌素降解能力，可进一步优化研究其对阿维菌素的降解性能。

2.3 单因素实验分析

2.3.1 温度单因素条件下微生物菌株对阿维菌素降解率的影响

温度是影响细菌生长的重要因素，而细菌的生长量能够间接反应出其对抗生素的降解性能。由图2可知，随着温度的升高，枯草芽孢杆菌的降解率在30～35 ℃时呈现上升趋势，在35 ℃时达到峰值，超过35 ℃则下降较明显，说明枯草芽孢杆菌的生长和对阿维菌素降解性能与温度关系密切。志贺氏菌的降解率在30 ℃时达到最大值，高于30 ℃呈下降趋势。当温度不为最适降解值时，细胞的生长均会受到影响，过高的温度会抑制细菌体内酶的活性，从而影响细菌正常生长，而过低温度会抑制细菌的代谢活力。此外，在不同温度下，枯草芽孢杆菌对阿维菌素的降解率均高于志贺氏菌。因此，35 ℃是枯草芽孢杆菌的最适降解温度，30 ℃是志贺氏菌的最适降解温度。

图2 不同温度下阿维菌素的降解率Fig.2 Degradation rate of avermectin at different temperatures

2.3.2 装样量单因素条件下微生物菌株对阿维菌素降解率的影响

由图3可知，当影响因素为装样量时，两种菌株对阿维菌素降解率的变化趋势基本一致，在40～60 mL时呈上升趋势，在装样量为60 mL时降解率达到峰值，大于60 mL时呈下降趋势。当装样量大于60 mL时，体积较大的无机盐培养基会抑制细菌的呼吸作用，从而阻碍细菌的生长；当装样量较小时，无机盐培养基无法给细菌提供充足的营养，较少的生存空间也会进一步阻碍细菌生长。此外，细菌代谢会产生一些有害物质，过少的装样量会限制有害物质的扩散，继而影响细菌生长。因此，60 mL为两种菌株的最适装样量。

图3 不同装样量条件下阿维菌素的降解率Fig.3 Degradation rate of avermectin at different sample loadings

2.3.3 初始菌种液量单因素条件微生物菌株对阿维菌素降解率的影响

由图4可知，随着菌种液量的增加，枯草芽孢杆菌和志贺氏菌对阿维菌素的降解率均呈现先增加后降低趋势。枯草芽孢杆菌对阿维菌素的降解率在0.625%～2.5%快速增大，在菌种液量为2.5%时达到峰值，初始菌浓高于2.5%～5%降解率则呈下降趋势。志贺氏菌对阿维菌素的降解率在0.625%～3.75%时逐渐增加，在菌种液量为3.75%时达到最大降解率，在3.75%～5%之间呈下降趋势。当菌种液量过大时，培养基中细菌数量较多，营养物质无法维持细菌的进一步繁殖，从而使降解率下降。当菌种液量过小时，细菌生长需要一定时间，在3 d内难以达到理想的降解浓度。同时，不同菌株的生长速率不同，从而影响其降解性能。因此，2.5%是枯草芽孢杆菌的最适菌种液量，3.75%是志贺氏菌的最适菌种液量。

图4 不同菌种液量下阿维菌素的降解率Fig.4 Degradation rate of avermectin at different bacterial concentrations

2.4 多因素实验设计2.4.1 枯草芽孢杆菌响应面试验设计及结果分析

根据单因素实验结果，选择温度30、35、40 ℃，装样量40、60、80 mL，菌种液量2.5%、3.75%、5%作为三因素三水平，利用Box-Behnken设计实验如表3。

表3 枯草芽孢杆菌响应面试验设计及结果分析Table 3 Response surface test design and result analysis of Bacillus subtilis

续表3(Continued Tab.3)

2.4.2 枯草芽孢杆菌降解阿维菌素模型的建立及显著性检验与方差分析

根据Box-Behnken中设计结果可知，该二次模型P=0.008 8<0.01，表明该模型是显著的，具有统计学意义。而失拟项P=0.074 6>0.05，表明该模型失拟项不显著，没有失拟因素存在。该模型回归方程为：

R=58.81+0.98A-4.65B+0.27C-4.67AB-0.58AC-8.46BC-8.88A2-23.40B2-7.75C2

由表4可知，方程中A2项和B2项P<0.05，表明A2和B2项对R值影响显著。根据分析结果，影响阿维菌素降解率的影响因子主次顺序为装样量>温度>菌种液量。

表4 枯草芽孢杆菌回归方程方差分析Table 4 Results of variance analysis of regression model of Bacillus subtilis

2.4.3 枯草芽孢杆菌降解阿维菌素模型的响应面交互分析

根据枯草芽孢杆菌的回归模型，选择将温度固定在一定水平，装样量和菌种液量交互影响作用的响应面图及等高线图进行分析。由图5可知，等高线呈现椭圆形，具有较好的显著性。在温度为35 ℃、装样量为60 mL、菌种液量为3.75%时，可从3D建模中得到阿维菌素最大降解率为53.52%。

图5 菌种液量和装样量交互影响降解率的响应面图Fig.5 Response surface of the effects of bacterial concentration and sample loading on degradation rate

根据Design Expert中Box-Behnken design中的优化功能，得到枯草芽孢杆菌降解阿维菌素的优化条件为温度为35.43 ℃、装样量57.56 mL、菌种液量为3.85%，此时理论降解率为59.15%。

2.4.4 志贺氏菌响应面试验设计及结果分析

根据单因素实验结果，选择温度25、30、35 ℃，装样量40、60、80 mL，菌种液量2.5%、3.75%、5%作为三因素三水平，利用Box-Behnken 设计实验如表5。

表5 志贺氏菌响应面试验设计及结果分析Table 5 Response surface test design and result analysis of Shigella

2.4.5 志贺氏菌降解阿维菌素模型的建立及显著性检验与方差分析

根据Box-Behnken中设计结果可知，该二次模型P=0.000 4<0.01，表明该模型是显著的，具有统计学意义。而失拟值P=0.091 8>0.05，表明该模型失拟项不显著，没有失拟因素存在，即说明建立所得模型可靠性高，可进行优化分析。该模型回归方程为：

R=65.30+11.14A+0.25B+3.36-1.70AB+0.30AC+0.96BC-27.82A2-14.10B2-10.41C2

为进一步验证所得方程的可靠性，采用回归方程方差分析。分析可知，方程决定系数R2为96.00%，说明该模型的拟合性较好，仅有总变异的4.00%不能用该模型解释，可用来为志贺氏菌降解阿维菌素进一步分析提供依据。根据表6可知，方程中A2项、B2项、C2项P<0.05，表明A2、B2、C2项对R值影响显著，其余均为不显著，即P>0.05。由F值分析可知，影响阿维菌素降解率的影响因子主次顺序为A温度>C菌种液量>B装样量。

表6 志贺氏菌回归方程方差分析Table 6 Results of variance analysis of regression model of Shigella

2.4.6 志贺氏菌降解阿维菌素模型的响应面交互分析

根据志贺氏菌的回归模型，选择将菌种液量固定在一定水平，装样量和温度交互影响作用的响应面图及等高线图进行分析。根据图6可知，等高线呈现椭圆形，具有较好的显著性。在温度为30 ℃、装样量为60 mL、菌种液量为3.75%时，可从3D建模中得到最大降解率为53.63%。

图6 温度和装样量交互影响降解率的响应面图Fig.6 Response surface of the effects of temperature and sample loading on degradation rate

根据Design Expert 中Box-Behnken design中的优化设计，得到志贺氏菌降解阿维菌素的优化条件为温度为30.45 ℃、装样量60.24 mL、菌种液量3.56%，此时理论降解率为65.34%。

2.5 验证实验

为确定优化后得到的方案的准确性，我们利用优化后的方案对阿维菌素进行降解实验。固定降解条件，令枯草芽孢杆菌和志贺氏菌分别对阿维菌素进行降解，进行3组平行实验。由表7可知，优化后，枯草芽孢杆菌对阿维菌素的降解率达到58.59%，与其理论值较为接近，误差仅为0.28%，同时比3D模型中得到的最大降解率高3%左右；志贺氏菌对阿维菌素的降解率达到66.47%，与其理论值较为接近，误差仅为0.57%，同时比3D模型中得到的最大降解率高18%左右。说明优化后方案显著提高了其降解效率，建立的模型拟合性较好，同时能够较为准确地预测各因素对最终降解率的影响，即响应面法能有效对降解条件进行优化。

表7 模型验证Table 7 Regression validation

3 讨论与结论

近年来，随着绿色工业的逐步发展，在处理环境污染物方面，利用微生物菌株进行降解逐渐成为研究者青睐的课题。由于阿维菌素水溶性较差，因此其在微生物降解法中周期较四环素类、β-内酰胺类抗生素更长，通常在15 d以上才能达到80%以上的降解效果。研究表明，仅有少部分菌株能够更加高效地降解阿维菌素，如伯克霍尔德氏菌能够在48 h内降解80%左右的阿维菌素[15]、嗜热脂肪芽孢杆菌在72 h对阿维菌素标准品的降解率可达到77.6%[16]。故研究并筛选出特定菌株有利于微生物降解法的进一步发展。

细菌一般通过代谢产生大环内酯类抗生素灭活转移酶对该类物质进行降解，这些灭活转移酶主要可以分为大环内酯酯酶、2′-糖基磷酸内酯转移酶mph1、糖基磷酸转移酶，它们能够促使抗生素分子结构发生磷酸化、糖基化，从而使抗生素失去其原有性质[17]。但目前常用于抗生素处理的菌株的降解机理仍未被完全探究，这也是现今研究者需要解决的难题。同时，近来研究也报道了一些能够产生大环内酯类灭活酶菌株，但并没有进行后续的降解性能测试，如肺炎支原体[18]、猪链球菌[19]、假单胞菌[20]等。

综合研究现状和存在问题，细菌降解阿维菌素的发展方向可分为以下几点：①对微生物菌株降解阿维菌素的机理进一步研究，为降解菌株的筛选提供依据。②通过筛选和组合不同种微生物菌株来达到更好的降解效果。③降低生产成本，选用价格适宜的培养基，培育生产周期短的菌种。④筛选出绿色环保、无二次污染的菌株能够有效避免对环境造成次生污染。

在菌株筛选实验中，枯草芽孢杆菌对阿维菌素的降解率较高，为21.76%；志贺氏菌的降解率较枯草芽孢杆菌略低，为17.91%。这说明枯草芽孢杆菌和志贺氏菌对阿维菌素有较强降解能力。进一步对这两株细菌的降解性能进行探究，在优化后条件下，枯草芽孢菌和志贺氏菌在实际降解中均有较好作用，但相对枯草芽孢杆菌，志贺氏菌的最佳降解温度较低，有利于减少实际降解中能量的消耗。然而志贺氏菌为常见致病菌，在处理环境中阿维菌素残留时可能会造成二次污染；枯草芽孢杆菌为非致病菌，对环境和人体不产生较大的影响，故能直接投入处理构筑物中，无需进行消毒处理，更为安全、环保，适合实际应用。