白酒中氨基甲酸乙酯形成机制、检测技术及控制研究进展

尤小龙，程平言，胡 峰，田栋伟，张二康，朱安然

(贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司,贵州习水 564622)

白酒是我国传统的蒸馏酒，也是我国特有的传统酒种，具有独特的工艺和风格，以其优异的色、香、味、格受到广大饮用者的喜爱，中国白酒工艺区别于西方蒸馏酒，例如自然接种、开放式的固态纯粮发酵等，造就了中西方蒸馏酒的不同风格[1-3]。在白酒酿造过程中，使用的多种原料辅料的部分含氮化合物，会生成氨基甲酸乙酯前体物质，继而被微生物转化导致食品中内源性的产生一种潜在的基因致癌化合物——氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）[4-5]。EC最先被国外学者在酸乳酪中检测发现，随后很多研究者在涉及到发酵生产工艺的食品及酒精饮料中也检测到了EC 的存在。随着人们对自身健康问题的重视及对白酒产品食品安全信息的关注，学者们对白酒中EC 的研究逐步广泛开展[6-7]。相关研究显示，白酒产品中的EC 含量检出限在239.40 μg/L[8]。虽然我国暂时并未制定白酒中有关EC 的强制性标准，但是白酒中EC 的问题已经引起了厂家和消费者的普遍关注。联合国粮农组织规定酱油中的EC 含量不得超过20.00 μg/L，酒精饮料中的标准首次是由加拿大政府于1985 年出台，其对各类酒精饮料中EC 的含量进行了限定，例如对蒸馏酒、白兰地、葡萄酒分别限量为150.00 μg/L、400.00 μg/L、100.00 μg/L[9]，我国现阶段对酒精饮料中EC 含量并未制定强制标准，许多名优酒企都暂时参照加拿大的国际限量对EC 进行控制。作为白酒的生产大国，随着中国白酒在全球市场日益火热，EC 生成机制及控制消除问题迫在眉睫。因此，探究如何有效抑制白酒酿造过程中产生的EC，有利于保障中国白酒在全球市场的地位，以及巩固中国白酒的国际形象。本文参考国内外的相关研究内容，针对白酒中EC 的危害、产生机制、检测技术及控制方法等方面进行综述，以期为中国白酒产品食品安全风险评估及处理提供理论依据。

表1 部分饮料酒中EC最高限量 (μg/L)

1 氨基甲酸乙酯概述及在白酒中形成机制

1.1 概述

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）又名乌拉坦、尿烷。在许多产业中，EC 都有广泛的用途，在工业领域，常用于制备改良氨基树脂产品，也常作为化学中间体用于纺织加工，使纺织产品的耐洗抗磨损性能增强；在医学领域，可作为催眠剂用作部分人群精神治疗，也常作为助溶剂辅助生产部分不易溶于水的镇静类药物；在日常生活中，部分杀虫剂和化妆品也将其作为添加剂使用[10-12]。但是在食品领域，它是一种在许多食品及酒精饮料发酵储藏过程中自然生成的副产物，被视作食品安全风险因素，一系列动物实验证明，EC 会增大动物机体肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病的患病风险，是一种潜在的基因致癌化合物，相关机制研究证明，动物体内部分未能代谢排出体外的EC，具有诱导毒性，会使活性氧过量产生，导致机体的氧化应激反应，降低细胞排毒能力和还原能力，诱发DNA 和蛋白质的破坏。同时部分人体内EC 将转化为乙烯基氨基甲酸酯、α-羟基乙基氨基甲酸酯和乙基-n-羟基氨基甲酸酯等乙烯基-氨基-甲酸酯环类氧化物，促进人体细胞DNA 的氧化损伤。人体内EC 及其衍生物的毒性会导致生物的机体产生癌变，1943年EC 首次被确认为致癌物，1974 年国际癌症研究机构将EC 归类为2B 类致癌物，2007 年正式将EC归类为2A级致癌物[13-16]。国内对EC的研究普遍集中于发酵的食品及饮料酒，例如酱油、黄酒、葡萄酒、威士忌、朗姆酒等的EC 定量检测中，针对其产生及控制机制研究较少[17-18]。

1.2 氨基甲酸乙酯在白酒中形成机制

EC 在白酒酿造过程中，其形成来源于多种前体物质，相关研究表明，在白酒的生产过程中，有不少于5 种前体物质通过不同的代谢途径转化为EC，这些前体物质根据在白酒中的主要代谢途径大体可分为两类，一类是经过尿素乙醇途径代谢反应生成EC的尿素反应相关化合物，例如尿素、瓜氨酸、精氨酸、氨基甲酸酯磷酸酯等；另一类是由氰化物乙醇代谢途径产生EC 的氰酸、氢氰酸等含氰基化合物，这类化合物统称氰化物[19]。

尿素是白酒中EC 产生的重要前体，早在1976年国外学者就通过实验证明，常温状态下尿素可与乙醇溶液反应生成EC，故尿素在各生产环节的含量直接影响了白酒中EC 的生成量。白酒生产中，尿素主要由酿造原料带入生产体系，在发酵过程中相关微生物的作用下，与乙醇进行反应生成EC。馏酒过程中，温度的升高加快尿素与乙醇的反应速率，EC 的含量会有较大幅度的升高，未反应的尿素还会在贮酒过程中继续反应产生更多的EC[20-21]。白酒中EC 的产生在很大程度上受尿素含量的影响。仇钰莹等[53]在对浓香型白酒中EC 形成机制的研究中发现，酿造原料和酒醅中均能检测到尿素，且含量较高，达到30～60 mg/kg。通过模拟蒸馏还发现尿素对白酒中EC 含量影响较大。尿素在许多酒精饮料发酵过程中都存在，且含量较高。常见酒类如黄酒在发酵过程中尿素含量可达25.65 mg/L，葡萄酒可达5.10 mg/L，白酒酒醅中可达55.73 mg/kg。

白酒产生EC 的另一个重要前体物质为氰化物，氰化物一般是氰酸、氢氰酸、含氰基化合物等形式存在的多种化合物的统称，以上任何一种氰化物存在形式均能与乙醇反应产生EC。国内外多项研究已证明EC在蒸馏酒中的主要前体物质之一是氰化物，其并非天然存在，是由氰糖苷自发转化而来，氰糖苷在多种发酵需要的植物中普遍存在，经加热裂解等化学反应即会生成氰化物，氰化物被氧化为氰酸盐后，氰酸根就会和乙醇分子反应生成EC[22-23]，氰化物易挥发，在蒸馏过程中很容易变为气态被带入馏分中，从而在气相或固相之间产生EC。中国白酒中的氰化物研究已取得了一定成果，被证明是中国白酒中EC最主要的前体物质[24-26]。

2 氨基甲酸乙酯在白酒中的检测方法

EC 的准确定量是EC 研究开展的前提，简单快速且精确定量EC 的检测方法研究近年一直持续进行，结合处理样品物理化学性质的差异，研究人员可以配合不同的前处理方法，搭配各种检测仪器，开展各种物质中EC 含量的检测，不同方法的检测限从0.1～30 μg/L不等。

2.1 前处理方法

EC 的检测样品大多数为发酵食品，样品中各类成分较为复杂，需要通过前处理去除其中对检测干扰较大的杂质，保证检测结果准确有效。前处理步骤一般包含提取、净化和富集等，溶剂萃取、固相萃取都是较为常见的EC 前处理方法。前处理时可以在样品中加入内标，用来消除系统误差，提升检测准确度，最常用的内标物是d5-EC。

2.2 色谱法

最早用于测定EC 的就是色谱法。气相色谱法（GC）一般用于分析沸点在500 ℃以下、相对分子量小于400、不易分解的物质，具有分析速度快、测定成本低等优点，现已成为各大检测机构最常用的EC 检测方法。但是GC 需要较为昂贵的仪器，操作步骤较为复杂，另外GC 仅靠保留时间来确定某种物质，对于复杂基质（如发酵食品）来说，EC 很容易受到样品中其他物质的干扰，很难准确、灵敏地测定EC 的含量，因而限定了GC 法的广泛应用。高效液相色谱（HPLC）仪器操作简单且仪器价格相对便宜，在整个检测领域应用更为广泛[27-28]。采用HPLC法检测EC，进样前需要在酸性条件下与占吨醇衍生，通过优化衍生条件和流动可达极低的检测限。但HPLC 法的缺陷也比较突出，对于乙醇含量较高的酒类，乙醇某种程度会干扰衍生反应，甚至在衍生时转化成EC，对样品进行稀释使乙醇含量一致的话又间接提高了定量限；对于部分带有颜色的酒精饮料，衍生前需要先进行脱色及除杂处理，导致整个实验时间被拖长。占吨醇与EC 的衍生反应是一个酸性条件的可逆反应，衍生过程不算稳定，会导致实验结果出现误差，加上衍生产物在230 nm 激发波长下有308 nm 和600 nm 两个发射波长，方法的稳定性无法保障[29-30]。

2.3 气相色谱-质谱法

气相色谱-质谱法（GC-MS）是目前为止在酒精饮料中使用最为广泛的EC 测定方法。GC-MS在GC 法高分离效能的优点基础上，具备了MS 的高鉴别特点，可以实现从构成较为复杂的样品中鉴别某一特定组分[31]。但是使用GC-MS 开展实验时，需要对样品进行较为复杂且耗时的前处理，过程步骤较多，导致分析误差增大，实验人员的前处理操作水平对检测结果的准确性影响很大，主观影响因素较多[32]。

2.4 气相色谱-串联质谱法

当样品的基质效应过强，或者样品的基质过于复杂，使用GC-MS 法测定其中的EC 含量就非常困难，各种基质极大的干扰了测定结果。固相微萃取可以一定程度解决上述问题，但固相微萃取技术操作和设备要求较多，实际操作麻烦。气相色谱-串联质谱法（GC-MS-MS）可以解决上述难题。2005 年，GC-MS-MS 技术首先被外国学者用于测定酒精饮料中的EC，其以m/z 44 作为定量离子峰，检出限为0.01 mg/L[33]。使用GC-MS-MS 技术可以快速、准确、灵敏及自动检测发酵食品及酒精饮料中的EC，但是GC-MS-MS 设备昂贵、后期维护成本高，对其广泛推广运用造成了巨大限制。

2.5 超高效液相色谱-质谱法

超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）是目前为止用来检测EC 的方法中，最为快速和高效的方法，其集合了LC 的分离能力以及质谱设备的高灵敏定量能力，对目标物的选择性能极佳，适用于基质复杂的样品测定，对样品的前处理过程极为简单，大部分情况下仅需对样品进行稀释或基质去除即可进样，测定结果准确、重现性好[34]。近年有学者利用了EC 分子源内裂解的特殊性质，在超高效液相色谱-高分辨质谱一级全扫描模式下，以EC母离子（m/z 90.05）及其子离子（m/z 62.02）作为定性离子，m/z 62.02 作为定量离子，开发出了酱香型白酒中EC 的一级子离子定量法，有效地解决了一级母离子定量噪音较大、二级子离子定量响应较低的问题[35]。总体而言，UPLC-MS 法具有分析速度快、检出限低、准确度高等优点，适用于酒精饮料中EC的监控。但同样的，因设备极为昂贵，导致其无法广泛应用。

3 氨基甲酸乙酯在白酒中的消减方法

白酒中EC 形成于酿酒的全过程中，重点集中于发酵、蒸馏、贮存三个阶段。根据EC 生成的主要机理，学者们从原辅料的处理、工艺的控制、发酵菌种选育改良以及原酒中直接去除等方面着手，针对EC本体以及EC生成的前体物质，开发了多种酒饮料中EC 含量的降除方法。目前去除EC 的途径主要有以下几个方面：

3.1 优化工艺

对生产工艺进行优化，可以达到减少EC 的目的[36]。对生产工艺的优化，可以从原辅料的筛选和处理着手，白酒酿造过程中高粱和小麦中的含氮量会对白酒中EC 生成量造成影响，原料种植过程中施加氮肥的用量会对尿素以及氰化物的含量造成影响，控制氮肥用量可以降低白酒的EC含量；对高粱、大米或者小麦的漂洗和精炼也可减少发酵过程中的尿素含量。以上工艺优化措施虽然可以控制EC 含量，可能也同时会对原料品质产生影响[37]。也可通过优化发酵过程条件控制EC 含量，多项研究显示，酿酒过程中多种环境条件会影响EC 的生成量，例如pH 值、氧气、储存器具、温度等，发酵过程中选用的菌株种类也会对EC 生成造成影响[38]。温度是影响发酵食品中EC 形成的重要因素，白酒酿造过程中，温度提升与酒的品质以及酒体质量稳定性有很大关联，但是也促进了EC 的形成。虽然温度影响EC 形成的机制暂未明确，但在较低温度下进行馏酒、贮存、发酵确实能降低EC 含量，在许多食品尤其是酒类发酵食品中均得到证实，例如在黄酒酿造过程中，通过降低煎酒、灭菌以及陈酿的温度，均可以有效减少黄酒中EC 的含量。除温度的直接影响外，对EC 热力学和动力学的深入研究表明，酒精如果通过金属容器蒸馏，在异氰酸为代表的EC 活性前体物质的催化作用下，EC 含量会增加，在蒸馏过程进行“去头掐尾”的工艺操作，EC 含量会显著降低[39-40]。王金梦等[41]的研究表明，将壶式二次蒸馏技术运用于浓香型白酒的中试生产中，EC 的绝对去除率可达97.1%。白酒醇厚的复合型香气来自于其独特的工艺，优化白酒生产工艺极大可能会改变酒体风味，所以许多通过优化工艺降低EC 的方法，都停留在理论阶段，因此优化工艺方法是否能在应用实际生产中减少EC 的含量还有待验证。

3.2 直接去除

除控制生产工艺外，运用物理和化学方法，对EC 进行直接降解、去除能有效降低EC。运用EC水解酶直接将EC水解成氨、乙醇和二氧化碳，相关研究从20 世纪80 年代起开展并取得了对应成果。日本学者在2006 年首次从马红球菌中分离得到了EC 水解酶[42]，对其生物序列开展分析，得出该酶对EC 的针对性不强，对系列氨基甲酸乙酯类化合物均有水解效果。随后，国外研究人员不断从青霉菌、柠檬酸杆菌、红酵母菌等菌株中分离出EC 降解酶[43-45]。李京京等[46]纯化了赖氨酸芽孢杆菌中EC 水解酶获得了纯酶，可耐受高浓度的酒精和盐分。现阶段针对EC 水解酶类的研究表明，天然微生物代谢获得的EC 水解酶酶活力整体偏低，且白酒普遍具有酸类、乙醇含量高的特点，故EC 水解酶除酶活需要达标之外，对其耐酸性和耐乙醇性也有较高要求，因此白酒中EC 的水解酶应用仍不成熟。

运用物理吸附或者吸附加过滤技术去除EC 也是一种有效且常见的方法，物理脱除EC 主要根据被脱去物的性质，选择不同的方式以及介质，常用的吸附介质有活性炭、硅胶、硅藻土、壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等，在酒类饮料中，应用范围最广泛的吸附介质为硅藻土和活性炭，硅藻土用于吸附黄酒中的EC 后能最大程度地保持酒体风味，故在黄酒中使用较多。天然硅藻土杂质含量较高，提纯改性等处理方法可提高其吸附性能，曹甜等[47-48]利用碱法改性硅藻土和壳聚糖改性硅藻土，探索其对黄酒中EC的吸附性能，结果发现经过碱处理后，硅藻土对黄酒中EC 的减除率大大提升，且处理后酒体风味与原酒基本一致。活性炭被更多应用于吸附白酒和酱油中的EC，由于活性炭吸附剂对EC 的吸附均为非特征吸附，白酒中微量风味成分会与EC 一起被吸附过滤，对白酒品质影响较大[49]。除一般吸附剂外，学者们也对树脂吸附酒精饮料中的EC 开展了研究，徐岩[50]首次采用苯乙烯基大孔树脂,研究建立了柱式连续吸附减除黄酒中高浓度EC 的技术方案，利用自行设计试制的500 L 级柱式连续吸附中试装置,对5 吨EC 含量在1000 μg/L 以上的陈年黄酒基酒样品进行应用试验，EC 浓度降低了近500 μg/L。

3.3 微生物改良

EC 的主要前体物质尿素，其代谢反应与发酵过程的酵母菌息息相关。已有研究表明，酿酒酵母在精氨酸代谢途径中代谢精氨酸产生尿素，正常情况下尿素能够通过氮代谢途径降解，但氮代谢因偏好型氮源存在发生阻遏效应时，尿素无法正常代谢，未被分解的尿素会被分泌到细胞外，导致尿素的积累[51]，不同的酿酒酵母具有不同尿素产生能力导致EC 含量不同，基于对酿酒酵母中尿素代谢的充分了解，利用基因工程改造酿酒酵母，减少尿素生成的方法，越来越被重视。根据精氨酸代谢生成尿素的反应，敲除或抑制尿素表达基因以及促进氮代谢反应基因的表达可以达到直接降低尿素含量的目的，即构建精氨酸酶缺陷的酿酒酵母或强化表达尿素分解代谢相关酶的酿酒酵母，系列研究证明了遵循该方向的研究实际效果较好。相关研究也表明，构建强化表达尿素分解代谢相关基因的菌株，遗传稳定性良好，不会引起发酵过程中发酵风味等特征的改变，但由于尿素代谢能够产生大量的氨，需要进一步考察对成品酒风味、滋味及贮藏特性的影响。通过氮代谢调控促进尿素代谢基因表达量升高能够显著降低发酵过程中尿素的积累量，赵鑫锐[52]通过改造四种尿素代谢的调控途径来降低发酵过程中的尿素积累，发现强化Dal81p 和Dal82p 的激活作用能够显著增强酵母对尿素的代谢能力，且二者共表达的基因工程菌比对照组降低了55.7 %。由于直接改造后缺失CAR1 基因的酵母不能利用精氨酸，会导致大量精氨酸浪费且影响风味，而且发酵过程也容易受到环境中野生酵母的污染导致效果不佳，因此，需要进一步考虑抑制或消除精氨酸代谢反应带来的影响。

4 展望

近年来白酒在酒精饮料市场的占有率日益提升，随着生活品质的提高，人们对白酒中EC 等内源性风险因子也开始重视，为给消费者带来更好的消费体验，明确白酒中EC 的产生原因、机制，以及结合生产实际情况，研究有效的EC调控措施，对促进我国白酒行业有序良性的发展，具有重大意义。同时，食品安全管理部门也应该结合消费者需求以及企业实际情况，制定相应的控制标准，保证EC 的研究更科学全面的开展。