孕酮对大鼠孕中期吸入七氟醚致1周龄子代神经损伤的保护作用及机制

高 荣，马 丽，王 川，常海霞，王 滨，李云峰，，冉玉华，郭文治

（1.山西医科大学麻醉学院，山西太原 030001；2.解放军总医院第七医学中心麻醉科，北京 100070；军事科学院军事医学研究院 3.毒物药物研究所，4.军事认知与脑科学研究所，北京 100850）

七氟醚（sevoflurane）是临床常用全身麻醉药物之一，因其诱导迅速、术中血液动力学平稳、苏醒较快的特点被广泛用于成人和小儿麻醉[1]。然而，2016年美国FDA对3岁以下儿童和孕妇手术麻醉提出了警告：发育早期多次接触七氟醚可能导致大脑发育异常[2]，并造成远期认知功能障碍[3]。近年越来越多研究表明，孕酮（progesterone，Prog）可改善神经损伤症状并提高认知学习能力，这一效果在多种神经损伤模型上均得到了证实[4-7]。但Prog对孕期七氟醚吸入导致的子代神经损伤是否有保护效应未见文献报道。本研究旨在探索Prog预给药对孕中期大鼠七氟醚吸入致幼龄子代大鼠神经损伤的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

15只SD孕大鼠，SPF级，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。饲养温度23～26℃，湿度50%～70%，12 h光暗循环（8∶00～20∶00灯光照明），自由摄食饮水。本研究动物实验经解放军总医院第七医学中心伦理委员会批准，批准编号：2022-55。

1.2 药品、试剂和主要仪器

七氟醚（凯特利），上海恒瑞医药有限公司；Prog，美国Sigma-Aldrich公司；2-羟丙基-β-环糊精，北京百灵克生物科技有限公司；FITC Annexin Ⅴ/7-AAD凋亡试剂检测盒，美国Tonbobio公司；胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；兔抗大鼠突触后致密蛋白95（postsynaptic density-95，PSD95）、突触蛋白1、桥尾蛋白、离子钙接头蛋白分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba-1）、胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、β肌动蛋白和GAPDH单抗，美国Abcam公司；兔抗大鼠胶质细胞源性神经营养因子（glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF）和酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor，TKR）单抗，武汉博士德公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗体，美国CST公司；小动物麻醉机，北京友诚嘉业生物科技有限公司；麻醉监护仪，美国GE公司；台式冷冻离心机，日本KUBOTA公司；FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司；样品冷冻研磨仪，北京赫德科技有限公司；冰冻切片机，美国Thermo公司；正置显微镜和数码显微成像系统，日本NIKON公司。

1.3 实验分组和七氟醚吸入损伤模型制备

孕鼠随机分为正常对照组、模型组和模型+Prog（2，4和8 mg·kg-1）组。模型组在孕11～16 d每日8∶00 am im给予溶剂（25%环糊精溶液），孕14～16 d给予溶剂1 h后吸入七氟醚（浓度2.5%，流量 2 L·min-1，2 h·d-1）制备七氟醚暴露模型[8]；模型+Prog（2，4和8 mg·kg-1）组在孕11～16 d im给予不同剂量Prog，孕14～16 d于同等条件下吸入七氟醚；正常对照组在孕11～16 d im给予溶剂，孕14～16 d于同等条件下吸入压缩空气。

所有孕鼠在七氟醚吸入过程中均进行氧饱和度和心率检测，以观察大鼠生命体征，处理结束后放回动物房正常饲养至子代出生。取1周龄子代大鼠（子鼠）海马组织进行后续检测。

1.4 流式细胞术检测子鼠海马细胞凋亡率

取子鼠海马组织置冰冷PBS缓冲液中，以0.125%胰蛋白酶37℃消化1 h至组织呈絮状悬液，悬液经100目滤网过滤，所得细胞悬液经300×g离心5 min，弃上清，加1 mL预冷PBS液，同等条件下重复离心2次弃上清，在所得细胞沉淀中加入250 μL 1×结合缓冲液，调节细胞密度至1×109L-1。取100 μL细胞悬液于流式管中，按照FITC Annexin Ⅴ/7-AAD凋亡试剂检测盒说明书，加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL 7-AAD溶液，混匀避光孵育30 min后使用FACSCalibur流式细胞仪检测，FlowJo_V10软件分析海马细胞凋亡率。

1.5 Western印迹法检测子鼠海马组织突触相关蛋白表达

依照文献[18]方法，取子鼠海马组织加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，加入研磨珠4℃研磨1 min，静置离心后取上清，BCA定量测定蛋白浓度，而后与2×上样缓冲液1∶1混合，100℃煮10 min后备用。配置分离胶和浓缩胶后上样，上样量为50 μg，80 V恒定电压电泳90 min，200 mA恒定电流转膜100 min，用5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST清洗3次后分别加入抗PSD95、突触蛋白1、桥尾蛋白、GDNF或TKR的一抗（均为1∶1000），4℃摇床过夜。TBST清洗3次后孵育荧光二抗（1∶5000），TBST清洗3次。以GAPDH或β肌动蛋白作为内参对照，使用Odyssey双色红外成像系统进行显影，Image J软件分析蛋白条带积分吸光度（integrated absorbance，IA）值，以目标蛋白与内参蛋白IA值的比值反映目标蛋白相对表达水平。

1.6 免疫荧光检测子鼠海马胶质细胞激活水平

取子鼠全脑浸泡在4%多聚甲醛中，4℃固定24 h，换30%蔗糖溶液脱水24 h，冰冻切片机切片，厚度为20 μm。使用PBS漂洗5 min，封闭液室温封闭3 h，弃封闭液，加入抗Iba-1或GFAP抗体，4℃过夜，回收一抗后用PBS漂洗，加荧光二抗，室温避光孵育2 h，弃二抗，用PBS漂洗，用DAPI封片后使用正置显微系统观察拍照。每张切片选取海马组织相同区域的3个不同视野，用Image J软件进行阳性细胞计数，以Iba-1阳性染色细胞数量反映小胶质细胞的激活水平，GFAP阳性染色细胞数量反映星形胶质细胞激活水平。

1.7 统计学分析

实验结果数据用±s表示，采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnettt检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Prog对子鼠海马细胞凋亡的影响

细胞凋亡检测结果（图1）显示，与正常对照组比较，模型组海马细胞早期凋亡率（P＜0.01）、晚期凋亡率（P＜0.05）和总凋亡率（P＜0.01）均显著升高；与模型组比较，模型+Prog各剂量组子鼠海马晚期凋亡率和总凋亡率均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+Prog 4和8 mg·kg-1组早期凋亡率也显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示Prog对七氟醚引起的子鼠海马神经细胞凋亡水平升高具有逆转效应。

Fig.1 Effect of progesterone（Prog）on apoptosis rate of one-week-old offspring rat（offspring rat）hippocampus cells by flow cytometry.The pregnant rats were divided into five groups.The model group and model+Prog groups were im given solvent or Prog（2，4 and 8 mg·kg-1） during the 11th-16thdays of pregnancy，and were inhaled given sevoflurane（concentration 2.5%，flow rate 2 L·min-1，2 h·d-1）1 h after drug treatment during the 14th-16thdays of pregnancy.The normal control group was im given solvent during the 11th-16thdays of pregnancy，and inhaled compressed air under the same conditions.The hippocampus of offspring rats was taken for detection.B，C and D were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.2 Prog对子鼠海马GDNF和TKR蛋白表达水平的影响

检测结果（图2）显示，与正常对照组比较，模型组GDNF（P＜0.05）和TKR（P＜0.01）蛋白表达水平显著降低；与模型组比较，模型+Prog 4和8 mg·kg-1组GDNF和TKR表达水平升高（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of Prog on levels of glial cellline-derived neurotrophic factor（GDNF）and tyrosine kinase receptor（TKR）expression in hippocampus of offspring rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 Prog对子鼠海马PSD95、突触蛋白1和桥尾蛋白表达水平的影响

突触相关蛋白检测结果（图3）显示，与正常对照组比较，模型组子鼠海马PSD95、突触蛋白1和桥尾蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，模型+Prog 8 mg·kg-1组PSD95表达水平升高（P＜0.05），模型+Prog 2和4 mg·kg-1组PSD95表达水平无显著变化；模型+Prog各剂量组突触蛋白1和桥尾蛋白表达水平均无显著变化。

Fig.3 Effect of Prog on levels of synapse-related protein expressions in hippocampus of offspring rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.PSD95：postsynaptic density-95.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.4 Prog对子鼠海马CA1区小胶质细胞激活水平的影响

海马CA1区小胶质细胞激活水平检测结果（图4）显示，与正常对照组比较，模型组CA1区Iba-1阳性细胞数量显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，模型+Prog 4和8 mg·kg-1组Iba-1阳性细胞数量显著减少（P＜0.01）。提示Prog可改善七氟醚诱导的子鼠海马CA1区小胶质细胞过度激活。

Fig.4 Effect of Prog on number of ionized calcium binding adapter molecule 1（lba-1）positive cells in hippocampus CA1 region of offspring rats by immunofluorescence staining.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semiquantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.5 Prog对子鼠海马CA1区星形胶质细胞激活水平的影响

海马CA1区星形胶质细胞激活水平检测结果（图5）显示，与正常对照组比较，模型组CA1区GFAP阳性细胞数量增加（P＜0.05）；与模型组比较，模型+Prog 4和8 mg·kg-1组GFAP阳性细胞数量减少（P＜0.05，P＜0.01）。提示Prog可改善七氟醚诱导的子鼠海马CA1区星形胶质细胞过度激活。

Fig.5 Effect of Prog on number of glial fibrillary acidic protein（GFAP）positive cells in hippocampus CA1 region of offspring rats by immunofluorescence staining.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

孕中期是临床进行妊娠期非产科手术最常见的一个时期[9]，是人类胚胎中枢神经系统发育的第1个关键时期，对外界刺激极其敏感[10]。本研究参照文献[11-13]选取孕中期SD大鼠进行七氟醚干预造模，参照文献[14-16]的造模浓度和方式，研究Prog对七氟醚吸入导致子代神经发育障碍的影响。

研究结果显示，大鼠孕中期七氟醚吸入引起子鼠海马神经细胞凋亡率上升，突触相关蛋白表达水平下降，提示子鼠可能存在神经元损伤和突触发育异常。该结果与文献[17-19]结果一致。Prog预给药逆转了七氟醚吸入引起的上述改变，表明Prog对七氟醚引起子代神经损伤具有预防效应，该结果与文献[20-22]报道一致。

既往研究表明，Prog在4～16 mg·kg-1剂量范围内均可改善突触可塑性，减轻神经损伤[23-24]。本课题组前期采用SD大鼠孕14～16 d吸入七氟醚制备七氟醚损伤模型[18]，并在孕11～16 d给予不同剂量的 Prog（1，2，4，8和 16 mg·kg-1）。结果发现，Prog 2 mg·kg-1即可逆转七氟醚引起的子代大鼠神经细胞凋亡水平升高。因此，本研究选取Prog 2，4和8 mg·kg-1研究Prog预处理对七氟醚引起的子代神经损伤的保护作用及相关机制。

本研究结果表明，Prog预处理可显著逆转大鼠孕中期七氟醚吸入所致子代海马Iba-1和GFAP阳性细胞数量增加，表明小胶质细胞和星形胶质细胞激活可能是Prog神经保护作用机制之一。小胶质细胞可被七氟醚激活，并进一步促进白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等促炎因子释放，从而造成神经元损伤[25]，据此推测，Prog对七氟醚导致子代神经损伤效应的预防作用可能与抑制小胶质细胞介导炎症反应有关。星形胶质细胞激活可介导多种营养因子释放。TKR是GDNF通路下游的一个跨膜酪氨酸激酶受体，是GDNF分子信号传入细胞内的枢纽。正常情况下GDNF可通过TKR激活胞内下游信号通路，进一步发挥神经营养作用，TKR可在疾病或药物等外界环境刺激下发生突变，表现为过度激活或失活[26]。本研究结果表明，Prog 4和8 mg·kg-1能显著逆转七氟醚吸入引起的子鼠海马GDNF和TKR表达下调，表明Prog的作用机制与激活GDNF/TKR相关通路有关。Prog对GDNF/TKR通路的精确调节机制有待深入研究。

激活的星形胶质细胞和小胶质细胞可通过维持或重塑突触可塑性，进而改变突触可塑性相关蛋白表达水平[27-28]。本研究检测了突触相关蛋白水平，以探讨Prog的神经保护作用是否在突触水平起效。结果发现，大鼠孕中期七氟醚吸入可引起子代海马PSD95、突触蛋白1和桥尾蛋白3种突触相关蛋白表达水平下降，表明其具有突触损伤作用，与文献[29]报道一致；而Prog可改善孕中期七氟醚吸入引起的子代海马PSD95水平下降。PSD95可调节兴奋性突触，是N-甲基-D-天冬氨酸受体的支架蛋白。在星形胶质细胞促进神经元之间突触形成的过程中，PSD95可能参与促进突触的形成[30]。推测Prog激活星形胶质细胞与促进PSD95水平升高可能具有协同效应，可进一步促进突触形成，改善七氟醚引起的突触损伤，发挥神经保护作用。

综上所述，Prog预处理可减轻大鼠孕中期七氟醚吸入对子代造成的神经损伤，该效应可能与抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活、促进GDNF/TKR表达、发挥神经营养作用、抑制海马神经细胞凋亡和突触相关蛋白水平下降有关。