丝状真菌培养及其产物的研究进展

李一华，徐贤柱

（江西师范大学 生命科学学院，江西南昌 330022）

丝状真菌俗称霉菌，是具有发达菌丝体且不产生大型子实体的一类异养真核生物。丝状真菌通常附着在有机物上生长，是地球上出现最早且分布最广的生物类群[1]。丝状真菌广泛存在于陆地土壤、水体及水体沉积物中，或以内生真菌的形式存在于植物根系或内部。丝状真菌是生物活性天然化合物的重要来源，其产物包括抗生素、多肽、多糖及植物激素等，其中部分产物具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌等作用，在医药、食品等领域都得到了不同程度的应用[2]。

1 丝状真菌的培养

1.1 半合成固体培养基培养

半合成固体培养基性质稳定，能够比较清晰地呈现丝状真菌的特征，往往用于丝状真菌的分离、鉴定与保藏。市售用于培养丝状真菌的半合成固体培养基主要为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），此外有沙氏琼脂培养基（SDA）、孟加拉红琼脂培养基等[3]。李志克等[4]从四川省阿坝州茂县沟口镇与叠溪镇花椒园取根腐病花椒病根样本，使用组织分离法，切取5 mm×5 mm样本，在PDA试管斜面培养基上进行分离培养，分离出了该种花椒根腐病的病原菌腐皮镰孢菌（Fusarium solani）。

1.2 半合成液体培养基培养

抗生素生产工业得到发展以后，液体发酵技术在真菌发酵产业中得到了广泛应用。用液体发酵的方式培养丝状真菌具有周期短、效率高、产量高及可连续等优势，发酵液中还会产生氨基酸、维生素、酶等多种化合物，因此是十分理想的丝状真菌产业化培养方式[5]。用于丝状真菌培养的液体培养基内往往包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等成分[6]。此外，在实际的生产发酵中，需要根据生产的不同需求及生产菌种的不同特性，针对性地对培养基成分（如碳源、氮源）进行改良，以达到高效生产的目的。

1.3 天然固体培养基培养

以木屑、大米、马铃薯等天然营养成分为来源的培养基也可以用于丝状真菌的培养。部分天然培养基的原材料为农作物余料或副产物，具有来源丰富、价格低廉的优势。王丽芳等[7]使用木屑基础培养基（木屑78%、石膏1%、玉米粉20%、蔗糖1%及固体基料重量80%的水，混合均匀取自然pH）对野生痂状炭角菌（Xylaria escharoidea）进行培养，并以基料重量1%的比例添加氨基酸，对木屑培养基进行优化。白永军等[8]使用大米培养基培养黄曲霉（Aspergillus flavus），并从大米培养基发酵液中分离鉴定出5种不同的次生代谢产物。实验结果表明，使用大米作为黄曲霉的培养基质可以在控制成本的同时得到丰富的产物。

2 丝状真菌产物的种类与应用

2.1 生产抗生素

人类利用抗生素已有近90年的历史。如青霉素的发现推动了抗生素工业的发展，催生了大量与抗生素相关的研究。然而，野生丝状真菌菌株往往在产量上不能满足生产的需求，生产上应用的工业菌株往往经过了不同手段的菌株改良，其效价和生产率与原始菌株相比高出3～5个数量级。段志钢等[9]采用高能电子诱变技术对黄青霉菌原生质体进行诱变，并结合高通量筛选方法，得到了青霉素高产的黄青霉菌菌株B13-15-36。该菌株发酵单位可达到14万U/mL，较之前提高了46%，同时优化了青霉素发酵工艺，得到了更低成本、更高效率的青霉素生产方法。

2.2 生产脂质

丝状真菌是优良的脂质来源。如高山被孢霉（Mortierella alpina）是一种具有代表性的产油丝状真菌，菌丝油脂含量高达自身干重的50%以上，产物多为长链多不饱和脂肪酸。目前，高山被孢霉主要用于生产其胞内油花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA），现已作为商业菌株被广泛投入生产。高山被孢霉产脂条件优化也是当前的研究热点之一。CHANG等[10]提出了高山被孢霉发酵花生四烯酸的一系列优化方案，包括以正己烷作为氧载体或提高氧分压提高溶解氧（DO）、采用分批补料系统维持有利于脂质积累的碳氮比、选择廉价复合氮源等。这些方法均能在控制生产成本的前提下提高高山被孢霉的脂质生产效率。

2.3 生产蛋白质类产物

丝状真菌可以通过顶端分泌的方式经胞吐作用分泌蛋白质，具有优越的蛋白质生产能力。与原核生物相比，丝状真菌具有成熟的翻译后修饰系统，在用于生产各类蛋白质产物时具有诸多优势。目前，市面上有超过50%的商用蛋白质都来源于丝状真菌。

丝状真菌本身可以产生种类多样的酶，经过分离筛选可以得到具有生产潜力的优良菌株。冯欣欣等[11]从新疆寒冷地区腐木中的真菌进行了6次分离和纯化，共得21个目标菌株，采用DNS法筛选出具有纤维素酶（CMC）活性的菌株，鉴定结果分别为脉纹孢菌（Neurospora sitophila）、桔绿木霉（Trichoderma citrinoviride）和产黄青霉（Penicillium chrysogenum）。实验表明，这些菌株均具有在低温条件下生产纤维素酶的优良特性。HE等[12]建立了一种将荧光激活细胞分选（FAC）技术与红色荧光蛋白DsRed表达偶联的高通量筛选方法，用于分离纤维素酶高产的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株，并使用该方法成功筛选出了两株纤维素酶高产的里氏木霉菌株，其纤维素酶活性分别较普通菌株高出46%和27%，验证了该方法用于筛选高产菌株的可行性。

丝状真菌经过基因工程等技术改造，亦可以用于生产异源蛋白。ARAKI等[13]运用减毒选择标记法标记大豆黄曲霉的启动子区域并将其截断，成功引入了异源蛋白的表达基因，建立了大豆黄曲霉异源蛋白高水平表达系统。该系统在非选择性培养基上也能维持其蛋白产量，可用于产业化蛋白质生产。

2.4 生产色素

生物色素可以从植物、动物和微生物中获得，这些天然来源的色素往往具有生物可降解、环境友好、毒性较低等优点。其中，动植物生产的色素具有色素不稳定、溶解性高、生产依赖季节等缺点，相比之下微生物具有生长速度快、产物稳定且不受季节影响的优点。而在微生物中，真菌不需要阳光、受外界因素影响较小，最适合用于工业化生产。近年来，不断有新的真菌被发现具有生产色素的能力，这些真菌广泛存在于海洋、陆地土壤及红树林生态系统等环境中。例如，拜莱青霉（Penicillium bilaii）是一种从澳大利亚塔斯马尼亚休恩港分离的海洋真菌，能够产生黄色真菌色素；新南威尔士州沙尔维附近采集的一种青霉分离菌被发现能够产生黄色色素等。

2.5 生产有机酸

有机酸是微生物发酵过程中产生的重要物质。丝状真菌可以产生种类多样的有机酸，其中不乏具有抗菌、抗氧化等生物活性的优良产物。柠檬酸是一种重要的平台化合物，目前作为化学产品的柠檬酸主要来自丝状真菌黑曲霉深层液体发酵。HU等[14]总结了丝状真菌黑曲霉的柠檬酸生产与优化策略，包括利用代谢工程手段使得黑曲霉的糖化酶基因过度表达、利用等离子体诱变得到高产突变株、优化培养基成分与发酵条件等。这些手段往往能使黑曲霉菌株的柠檬酸产量较原始水平有很大幅度的提高，较大限度地发挥黑曲霉的生产能力。

2.6 其他产物

除了上述产物以外，在真菌次级代谢产物中还有大量结构新颖的生物活性化合物被不断发现。刘碧丽等[15]使用乙酸乙酯萃取及减压硅胶柱洗脱等方法对一株海底沉积物来源的青霉菌（Penicillium polonicumH92）进行分离纯化与液体发酵，从发酵液中分离出7种次生代谢产物，包括4个喹啉酮类化合物、2个二酮哌嗪类化合物和1个生物碱，其中部分化合物被证明对流感病毒神经氨酸酶具有抑制活性。赵江源等[16]对一种土壤真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的固态发酵物采用硅胶柱层析和Sephadex LH-20分离纯化，并使用核磁共振波谱法进行结构鉴定，分离出13种化合物。在后续的抗氧化活性实验中，证明化合物8（ourosperone A）对ABTS＋（IC50为0.155 mg/mL）、DPPH（IC50为3.453 mg/mL）自由基具有一定的清除效果。

ORBAN等[17]提出，丝状真菌来源的芳香性物质在许多产业尤其是食品产业也具有巨大的应用前景。许多丝状真菌能够产生兼具营养与风味的特殊成分，包括多种醇类、酮类和酯类化合物。这些具有芳香气味的化合物能为发酵类的食物提供特有的风味与营养价值，作为食品添加剂或香料也具有优秀的潜力。

3 结语

丝状真菌作为一种常见的微生物，对其培养与利用已具有漫长且深厚的基础；20世纪青霉素被发现以来，丝状真菌及其产物的研究更是进入了新的纪元。丝状真菌分布广泛、种类繁多、容易大规模培养，且多数具有性质稳定、环境友好、毒性较低或无毒的优点，是非常理想的产业化微生物，在医药、食品、农业等许多领域都占据了重要的地位。然而到目前为止，还有许多丝状真菌的发酵产业处于产率较低、产物品质较差的状态，许多优化手段也还停滞在试验阶段。此外，部分丝状真菌菌种还具有会自身降解产物、产量不稳定、培养条件复杂等缺点。因此，如何有效优化培养方式并投入应用、如何选育高产且稳定的优良菌株是丝状真菌资源研究的当务之急。

近年来不断有新颖的化合物从丝状真菌中被分离，但其中许多化合物的具体结构及产生机理还未能明了。随着蛋白质组学、基因组学等学科的发展及联合质谱等技术的跟进，丝状真菌及其产物的应用还有着无限的可能性。