不同产地、不同提取方法对余甘子多酚含量及抗氧化活性的影响

李晓强，胡 坤，龚玉石，胡 勇，王 颖，郭 娟

（广东药科大学食品科学学院，广东广州 510006）

余甘子（Phyllanthus emblicaL.）是一种热带、亚热带落叶灌木或小乔木，属大戟科（Euphorbiaceae）叶下球属（Phyllanthus），果实呈球形，浅绿色，光滑而坚硬，俗名滇橄榄、油甘子、庵摩勒、庵婆罗果、喉甘子等，主要生长在热带、亚热带地区，印度和中国产量最高，是联合国卫生组织指定在全世界推广种植的三种保健植物之一，也是我国重要的经济林果[1]。余甘子果实可加工制作成营养保健品、药品、饮料、喉片等，具有清热止咳、健胃消食等功效[2-4]，这是因为余甘子果实中含有大量生物活性成分，例如多酚类、萜类、黄酮类物质，其中多酚含量较高[5]，且具有广泛的生理功效，例如抗氧化、抗肿瘤、降血脂、保肝、提高免疫力、抗衰老等[6-8]。

目前国内外对余甘子多酚的研究主要集中在提取方法的优化、多酚成分分析、功能活性研究等方面[9-11]，对于不同产地和不同方法提取所得余甘子多酚在含量和抗氧化活性方面的比较研究相对较少，然而这正是研究开发余甘子多酚的一个重要环节，不仅可为余甘子果实中多酚的提取提供产地和提取方法的参考，还有助于余甘子的进一步研究，例如产地是如何影响余甘子果实中多酚含量及其抗氧化活性的，提取方法能否进一步优化，以及对多酚的其它生物活性有无影响等。

本文通过对不同产地和不同方法提取所得余甘子多酚的含量和抗氧化活性进行研究，揭示不同产地和不同提取方法对余甘子多酚含量和抗氧化活性的影响，旨在为我国余甘子开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

余甘子粉 于2022年10月收取广东、广西、福建、云南、海南产的新鲜余甘子果，经清洗、去核、榨汁、干燥、粉碎、过40目筛后制成粉末；没食子酸

纯度大于98%，Sigma公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH） 纯度大于96%，Aladdin Chemistry Co., Ltd；2,2-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS） 纯度大于98%，Tci；无水乙醇、福林酚试剂、碳酸钠 分析纯，广州化学试剂厂；水杨酸分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；硫酸亚铁分析纯，天津市福晨化学试剂有限公司；过氧化氢分析纯，天津市百世化工有限公司。

JYL-C012型组织捣碎机 山东九阳公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；721N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；EM7KCGW3-NR微波炉 广东美的厨房电器制造公司；KQ-600DE超声波提取器 昆山市超声仪器有限公司；亚临界水提取器 自制。

1.2 实验方法

1.2.1 不同产地余甘子中多酚的提取 参考文献[12]溶剂浸提法并稍加改动：分别取5个不同产地的余甘子粉各5.0 g，分别加入150 mL 60%乙醇溶液，于60 ℃水浴中浸提80 min，过滤，复提一次，取滤液1 mL，蒸馏水稀释100倍，作为样品溶液。

1.2.2 不同提取方法提取余甘子中多酚 微波-热水浸提法：称取云南所产余甘子粉5.0 g，加入100 mL超纯水，560 W微波处理3 min，再用50 ℃水浴浸提6 min后取出，抽滤后残渣按上述条件复提1次，合并滤液待用[13]。

溶剂浸提法：参考文献[12]溶剂浸提法并稍加改动。称取云南所产余甘子粉5.0 g，加入150 mL 60%乙醇溶液，于60 ℃水浴中浸提80 min，过滤，复提一次，取滤液1 mL，蒸馏水稀释100倍，作为样品溶液。

超声波提取法：称取云南所产余甘子粉5.0 g，加入100 mL 70%乙醇溶液，于300 W超声处理90 min，抽滤后滤渣复提1次，合并滤液待用[14]。

微波提取法：称取云南所产余甘子粉5.0 g，于100 mL，70%乙醇溶液中，设定微波功率210 W进行100 s微波处理，真空抽滤后重复提取1次，合并滤液得到余甘子提取液[15]。

亚临界水提取法：参考文献[16]称取云南所产余甘子粉5.0 g 于高压反应釜内，加入80 mL蒸馏水，200 ℃、200 r/min萃取10 min，快速冷却，抽滤，离心得余甘子提取液。

1.2.3 多酚含量的测定 多酚含量测定采用Folinciocalteu法[17-18]。以没食子酸为标准品，取不同浓度没食子酸标准溶液置于10 mL比色管中，加入福林试剂1.0 mL，充分震荡后静置4 min，加入10%Na2CO3溶液1.0 mL，混匀，蒸馏水定容，30 ℃恒温水浴避光反应2 h，在765 nm 处测吸光值，同时做试剂空白，以没食子酸标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。取样品液0.1 mL于10 mL比色管中，按上述实验方法在765 nm处测样品的吸光度值（A），计算样品中的多酚含量，多酚含量用mg GAE/g余甘子粉来表示。计算公式如下：

式中：A为没食子酸浓度（mg/mL）；V为定容后体积（mL）；m为原料样品质量（g）。

1.2.4 抗氧化活性分析

1.2.4.1 DPPH·清除率的测定 参照文献[19]的方法略作修改，取0.02 mL样品液及0.5 mmol/L的DPPH溶液3 mL于同一具塞比色管中，摇匀，37 ℃恒温水浴避光静置15 min，以无水乙醇为空白在517 nm处测得吸光度Ai，以0.02 mL样品液和3 mL乙醇在517 nm处测得吸光度Aj，以3 mL DPPH和0.02 mL乙醇在517 nm处测得吸光度A0。DPPH·清除率的计算公式如下：

式中：Ai为加入样品之后的吸光度；Aj为同体积无水乙醇代替DPPH溶液所测的吸光度；A0为同体积无水乙醇代替样品溶液的空白对照组的吸光度。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除率的测定 参见文献[20]的测定方法进行，将7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液等体积混合，室温避光静置一夜，使用前用pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使其吸光度值在734 nm波长达0.70±0.02，即为ABTS工作液。将样品提取液经过适当的梯度稀释后，精确吸取10 μL于10 mL比色管中，加入ABTS工作液3.0 mL，室温下避光静置6 min，于734 nm波长下测定吸光度值（Ai），以PBS缓冲液代替ABTS工作液测定对照吸光度（Aj），以超纯水代替样品测定空白吸光度值（A0），用PBS缓冲液调零。ABTS+自由基清除率的计算公式如下：

式中：Ai为加样之后所测的吸光度；Aj为同体积PBS缓冲液代替ABTS工作液所测的吸光度；A0为同体积超纯水代替样品液的空白对照组的吸光度。

1.2.4.3 ·OH清除率的测定 采用水杨酸滴定法[21]，先向试管中加入9 mmol/L的水杨酸和9 mmol/L的FeSO4各1 mL，再加入2 mL样品液，最后加入1 mL浓度为9.8 mmol/L的H2O2进行显色反应，混合摇匀后于37 ℃水浴反应30 min，在510 nm波长下测定混合物的吸光值（Ai）。用超纯水代替H2O2溶液测得对照吸光值（Aj）。用45%乙醇溶液代替样品测得吸光值（A0）。·OH清除率的计算公式如下：

式中：Ai为加样之后所测的吸光度；Aj为同体积超纯水代替H2O2溶液所测的吸光度；A0为同体积45%乙醇溶液代替样品液所测的吸光度。

1.3 数据处理

所有实验重复3次，结果以平均值±标准差（X±SD）表示，采用Origin 2021软件分析实验数据，平均值的差异性用单因素方差分析法进行差异显著性分析，P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 余甘子多酚含量比较

2.1.1 不同产地余甘子提取所得多酚含量的比较由图1可以看出，不同产地余甘子提取所得多酚在含量上有显著（P＜0.05）差异，按含量由多到少排序为：云南＞福建＞广西＞海南＞广东，其中云南所产余甘子提取所得多酚含量为345.24 mg GAE/g，广西为242.86 mg GAE/g，福建为260.25 mg GAE/g，海南为212.73 mg GAE/g，广东所产余甘子提取所得多酚含量最低，为198.83 mg GAE/g，云南所产余甘子提取所得多酚含量为广东的1.7倍，这种差异的存在可能与余甘子本身的生长环境、品种等因素有关，即便是同一产地，栽培方式不同，多酚含量也会不同，刘晓丽等[22]研究发现广东栽培余甘子和野生余甘子提取所得多酚含量分别为185.13和204.15 mg GAE/g。Li等[23]比较了广东（云浮、普宁、汕头），广西（南宁、梧州），福建（泉州、漳州），云南（楚雄、大理、保山）共10个不同产地所产余甘子提取所得多酚含量，并建立了简便、可靠的高效液相指纹图谱分析方法，发现云南所产余甘子提取所得多酚含量较高，与本研究结论一致。

图1 不同产地余甘子提取所得多酚含量的比较Fig.1 Comparison of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats

2.1.2 不同提取方法对余甘子多酚含量的比较 由图2可以看出，不同方法提取所得余甘子多酚含量有所不同，按含量由多到少排序为：亚临界水提取法＞溶剂浸提法＞超声波提取法＞微波-热水提取法＞微波提取法。其中亚临界水提取所得多酚含量为387.33 mg GAE/g，溶剂浸提为321.34 mg GAE/g，超声波为276.72 mg GAE/g，微波-热水为274.56 mg GAE/g，微波为223.58 mg GAE/g，亚临界水提取所得多酚含量显著（P＜0.05）高于其它四种提取方法，是由于水在亚临界状态下具有高浓度的离子积，可以作为酸碱催化剂催化相关反应，并且随着水的粘度和表面张力降低，使提取过程中介质的渗透能力增强，提高了基质在溶剂中的扩散系数和传质效果，这些因素使得亚临界水提取极性和非极性多酚的能力大大增强，从而提高了多酚的提取率[24]。溶剂浸提法、微波提取法和超声波提取法是用乙醇作为溶剂，可能会导致某些不溶于乙醇的多酚成分无法被提出，并且超声波可能会破坏多酚成分；微波-热水提取法用50 ℃热水提取，可能会导致某些水溶性较差的多酚溶解度减小，从而导致提取所得多酚含量降低。大量研究表明，亚临界水能提高多种植物中的多酚提取率，是一种高效的提取多酚的方法[25-26]。

图2 不同方法提取所得余甘子多酚含量的比较Fig.2 Comparison of polyphenols content of Phyllanthus emblica extracted by different methods

2.2 余甘子多酚的抗氧化活性

2.2.1 余甘子多酚对DPPH·的清除能力 由图3可以看出，不同产地余甘子提取所得多酚对DPPH·的清除率都较高，都在70%以上，但不同产地之间存在差异，其中福建所产余甘子提取所得多酚对DPPH·的清除率最高，达89.26%，广西为83.63%，广东为79.15%，海南为74.36%，云南所产余甘子提取所得多酚对DPPH·的清除率最低，为70.01%，这可能与不同产地余甘子提取所得多酚的组成成分有关，植物多酚是一类分子中具有多个羟基酚类的植物成分的总称，其中多酚的结构、组成不同其抗氧化活性也就不同。由图4可以看出，不同方法提取所得余甘子多酚对DPPH·的清除率不同，其中亚临界水法提取所得余甘子多酚对DPPH·的清除率最高（多酚浓度10～60 μg/mL，清除率从23.72%上升至95.05%），超声波提取所得余甘子多酚对DPPH·的清除率最低（多酚浓度10～60 μg/mL，清除率从12.26%上升至70.32%）。这可能是由于不同方法的提取原理不同，导致所提取多酚成分不同，从而导致多酚对自由基清除能力不同。超声波是利用声空化作用将样品击碎，同时超声波产生的振动作用加强胞内物质的释放、扩散和溶解；亚临界水提取是通过调节温度和压力改变水的性质从而实现更高温度条件下的选择性提取，提取组分的纯度更高。余甘子提取物中主要以酚类物质为主，酚类物质中的酚羟基提供的电子和DPPH·中的孤对电子有效结合，从而清除DPPH·。可以看出，随多酚浓度的增大，其对DPPH·的清除能力明显增强，浓度和清除率呈现较为明显的量效关系。计算得到亚临界水、微波-热水、溶剂浸提、微波、超声波5种方法所提的余甘子多酚对DPPH·清除率的IC50分别为24.47、33.58、36.15、39.12、40.54 μg/mL，可以看出亚临界水提取所得多酚对DPPH·清除率明显强于其他方法。

图3 不同产地余甘子提取所得多酚对DPPH·的清除能力Fig.3 DPPH· scavenging ability of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats

图4 不同方法提取所得余甘子多酚对DPPH·的清除能力Fig.4 DPPH· scavenging ability of Phyllanthus emblica polyphenols extracted by different methods

2.2.2 余甘子多酚对ABTS+自由基的清除能力 由图5可以看出，不同产地余甘子提取所得多酚对ABTS+自由基的清除率均很高，在97%以上，但不同产地之间清除率的差异并不显著，其中云南所产余甘子提取所得多酚对ABTS+自由基的清除率略高于其它地区，为98.66%。由图6可知，不同方法提取所得的余甘子多酚对ABTS+自由基的清除率不同，其中亚临界水提取所得余甘子多酚对ABTS+自由基的清除率最高（多酚浓度10～60 μg/mL，清除率从21.16%上升至97.44%），溶剂浸提法提取所得余甘子多酚对ABTS+自由基的清除率最低（多酚浓度10～60 μg/mL，清除率从13.20%上升至74.23%），这可能与不同方法所提多酚成分和含量不同有关，可以看出多酚浓度与ABTS+自由基清除率呈现较明显的量效关系。计算得到亚临界水、微波-热水、溶剂浸提、微波、超声波5种方法所提的余甘子多酚对ABTS+自由基清除率的IC50分别为26.89、39.32、47.33、34.24、35.66 μg/mL，可以看出亚临界水提取所得多酚对ABTS+自由基的清除率明显强于其他方法。

图5 不同产地余甘子提取所得多酚对ABTS+自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effect of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats on ABTS+ radical

图6 不同方法提取所得余甘子多酚对ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging effect of Phyllanthus emblica polyphenols extracted by different methods on ABTS+ radical

2.2.3 余甘子多酚对·OH的清除能力 由图7可以看出，不同产地余甘子提取所得多酚对·OH的清除率有显著差异，按清除率由高到低排序为：云南＞福建＞海南＞广西＞广东，其中云南所产余甘子提取所得多酚对·OH的清除率最高，达85.89%，福建为73.39%，海南为67.73%，广西为62.12%，广东为50.3%。由图8可知，不同方法提取所得的余甘子多酚对·OH的清除率存在差异，其中亚临界水提取所得的余甘子多酚对·OH的清除率最高（多酚浓度50～350 μg/mL，清除率从29.12%上升至96.81%）。溶剂浸提法提取的余甘子多酚对·OH的清除率最低（多酚浓度50～350 μg/mL时，清除率从15.37%上升至80.22%），可以看出，随着多酚浓度增大，不同方法提取所得余甘子多酚对·OH清除能力明显增强，清除率与浓度呈较明显量效关系。计算得到亚临界水、微波-热水、溶剂浸提、微波、超声波5种方法所提的余甘子多酚对·OH的清除率的IC50分别为122.41、191.34、213.52、205.66、190.83 μg/mL，可以看出亚临界水提取所得多酚对·OH的清除率明显强于其他方法。

图7 不同产地余甘子提取所得多酚对·OH的清除能力Fig.7 ·OH scavenging ability of polyphenols extracted from Phyllanthus emblica from different habitats

图8 不同方法提取所得余甘子多酚对·OH的清除能力Fig.8 ·OH scavenging ability of Phyllanthus emblica polyphenols extracted by different methods

综上所述，在所研究的5种提取方法中，亚临界水提取所得多酚在含量和抗氧化活性上都优于其他方法，唐仕荣等[27-28]采用溶剂回流、超声波、微波、超声波微波协同萃取和亚临界水萃取多酚时也发现亚临界水法所提多酚含量较高，且所提多酚抗氧化活性能力较强，和本文研究结论相符。

2.3 多酚含量与自由基清除能力的相关性分析

2.3.1 不同产地余甘子提取物多酚含量与自由基清除能力的相关性 本文分析了不同产地余甘子提取所得多酚含量与自由基清除能力的相关性，如表1所示，不同产地余甘子提取所得多酚含量与DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除率显著正相关（P＜0.05），相关系数分别为0.953、0.992和0.841，表明多酚含量越高，对DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除率越高，表明多酚类化合物是余甘子清除DPPH·、·OH和ABTS+自由基的重要功效成分，因产地不同，提取所得多酚含量就不同，因此对自由基清除能力也不同。

表1 不同产地余甘子提取所得多酚含量与自由基清除能力的相关性分析Table 1 Correlation analysis between polyphenol content and free radical scavenging ability of Phyllanthus emblica from different habitats

2.3.2 不同方法提取所得余甘子提取物多酚含量与自由基清除能力的相关性 如表2所示，不同方法提取所得余甘子多酚含量与DPPH·、·OH 和ABTS+自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05），相关系数分别为0.995、0.998、0.992；由于不同方法提取所得多酚含量差异显著，因此，当选用不同的提取方法时，所得多酚含量会有所不同，从而导致自由基清除率不同，采用所得多酚含量越高的提取方法，得到多酚对DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除率也会越高。

表2 不同方法提取所得余甘子多酚含量与自由基清除能力的相关性分析Table 2 Analysis of correlation between polyphenols content and free radical scavenging ability of Phyllanthus emblica extracted by different methods

3 结论

本文选取广东、广西、福建、云南、海南5个不同产地和微波-热水浸提、溶剂浸提、超声波、微波和亚临界水5 种不同提取方法，比较不同产地和不同提取方法对余甘子多酚含量和抗氧化活性的影响。结果表明，产地不同和提取方法不同对多酚的提取效果也不同，按含量由高到低排序为：云南＞福建＞广西＞海南＞广东，亚临界水提取法＞溶剂浸提法＞超声波提取法＞微波-热水提取法＞微波提取法。DPPH·、·OH和ABTS+自由基清除试验表明，余甘子多酚具有良好的清除自由基作用，清除率与多酚浓度呈明显的量效关系，其中亚临界水提取所得多酚的自由基清除率最高。余甘子含有丰富的生物活性物质以及诸多的生理功效，且我国余甘子资源丰富，本文仅对部分产地和不同方法提取所得余甘子多酚的含量和抗氧化活性进行了研究，对于产地自然环境对余甘子多酚含量及生物活性的影响机制以及不同方法提取所得多酚的具体组成成分和各种成分的生理功效还有待进一步研究。