采用高效液相色谱仪串联示差折光检测器分析原料糖浆中低聚麦芽糖组分方法的探讨

徐煜琪

上海工微所科技有限公司，上海 200233

麦芽糖(maltose)是由两个葡萄糖经α-1,4糖苷键连接而成的二糖，又称为麦芽二糖。因C1羟基位置不同，而分为α-和β-两种异构体[1]。

低聚麦芽糖一般是以淀粉为原料，经酶法生产含3～8个葡萄糖分子的碳水化合物，能经小肠逐步消化吸收。低聚麦芽糖的渗透压为葡萄糖的1/4，其甜度为蔗糖的40%，生理特点是被吸收利用的速度比单糖和双糖慢，一次摄入后可以维持较长时间的能量补充；同时，维持胰岛素和血糖之间的相对平衡[2]。

奶糖糖果，是以食糖或糖浆或甜味剂、乳制品等为主要原料，制成具有乳香味的糖果[3]。在奶糖糖果中，胶质型奶糖糖果多数以低聚麦芽糖浆为底料。而其中，麦芽四糖(maltotetraose)与麦芽五糖(maltopentaose)对胶质型奶糖糖果口感的影响尤其显著，随着麦芽五糖的的比例升高，胶质型奶糖糖果会更硬，反之亦然[3]。同时，麦芽四糖和麦芽五糖的价格也相对较高。因此在原料麦芽糖浆中，麦芽四糖与麦芽五糖在糖浆中的占比就显得尤其重要。快速、有效的检测原料糖浆中麦芽四糖与麦芽五糖就有着重要的意义。

现在，低聚麦芽糖的液相分析方法，常用的色谱柱有钙柱、糖柱、氨基柱等类型。最常用的为离子交换型色谱柱，配合使用检测器为蒸发光散射检测器(EvaporativeLight-scattering Detector，ELSD)，或脉冲安培检测器(Pulsed Amperometric Detector，PAD)[4-5]，也有报道使用高效液相色谱串联电喷雾检测器(HPLC-CAD)来检测糖类物质[6]。但由于钙柱、糖柱等价格高，分析参数单一；蒸发光散射检测器(ELSD)和脉冲安培检测器(PAD)的购置成本、维护成本和维护要求都很高，而且检测器通用性差。对于日常的低聚麦芽糖浆验收而言，成本过高，实际应用性较差。

示差折光检测器(Refractive Index Detector，RID)是根据不同物质具有不同的折射率来进行组分监测。凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可以使用这种检测器[7-8]。示差折光检测器(RID)分为反射式和折射式两种。作为通用型检测器，示差折光检测器(RID)能分析无紫外吸收的物质，尤其是糖类，使用方便，设置简单，大多食品检测实验室都有配备。

参考GB 5009.8—2016 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定[9]，GB/T 20881—2007 低聚异麦芽糖[10]，GB/T 20883—2017 麦芽糖中，提及对葡萄糖，麦芽糖，低聚麦芽糖的测定方法[11]，如使用常规的外标法进行定量计算，需购置单一的纯度较高的低聚麦芽糖的标准品，成本较高。因此本文使用标准物质根据保留时间进行初步定位，然后采用面积归一法，计算低聚麦芽糖各组分含量。可降低成本，同时也具有一定的参考价值。

1 实验方法

1.1 实验标准品及试剂

葡萄糖纯度标准物质(纯度99.0%)，D-麦芽糖(纯度94.9%)，麦芽三糖(96.0%)，麦芽四糖(99.0%)(上海安谱实验科技股份有限公司)。乙腈购买于上海迪马科技有限公司。实验使用水都为一级水。

1.2 实验仪器及设备

METTLER TOLEDO 电子天平MS204S/02，METTLER TOLEDO 电子天平XS205 DualRange，IKA VORTEX GENIUS 3涡旋振荡器，Agilent LC1260液相色谱仪(Agilent 1260 Quat Pump VL G1311C四元泵，Agilent 1260ALS G1329B自动进样器，Agilent 1260TCC G1316A柱温箱，Agilent 1260RID G1362A示差折光检测器)，Waters XBridge® BEH Amide 5 μm×4.6 mm×250 mm Column色谱柱+Waters XBridge® BEH Amide 5 μm VanGuard® Cartridge 3.9 mm×5 mm保护柱。

1.3 实验过程

准确称取2.0 g样品于100 mL容量瓶中，加30 mL一级水溶解样品，涡旋1 min后，用水定容至刻度，混匀后，过0.45 μm水相微孔膜后，供仪器检测。

分别准确称取葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖标准品0.010 g，用一级水溶解后，定容至10 mL，各取4种标准溶液2.00 mL，用一级水定容至10 mL后，过0.45 μm水相微孔膜后，供仪器检测。

1.4 液相条件

采用乙腈-水在不同的配比下，配合不同的柱温条件，考察各组分的分离度。

采用乙腈-水比例为50∶50、55∶45、60∶40。流速设置为1.0 mL/min，柱温箱温度设定为：30 ℃、35 ℃、40 ℃。检测器温度设定为40 ℃。

2 结果与讨论

2.1 不同流动相比例的比较

在柱温箱设置温度为30 ℃时，采用不同的乙腈与水的混合比，对低聚麦芽糖标准品混合样品进行高效液相色谱分析，得到相应图谱。

采用乙腈∶水=50∶50，如图1所示，各组分不能分离。

图1 乙腈∶水=50∶50葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖标样色谱图

采用乙腈∶水=60∶40，如图2所示，各组分可以完全分离，但是随着聚合度提高，色谱峰有前沿，而且所需检测的糖浆中，有聚合度>5以上的低聚麦芽糖，单个样品所需检测时间较长。

图2 乙腈∶水=60∶40葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖标样色谱图

采用乙腈∶水=55∶45，如图3所示，出峰顺序依次为：葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖。各色谱峰峰型较好，保留时间合适，且考虑所需检测的糖浆中聚合度 >5以上的的低聚麦芽糖出峰时间推断，一般检测单一样品的时间不超过20 min。因此，采用乙腈∶水=55∶45最为合适。

图3 乙腈∶水=55∶45葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖标样色谱图

2.2 不同柱温箱温度的比较

查询色谱柱说明书显示，该色谱柱一般耐受温度为50 ℃以下，因此在乙腈∶水=55∶45条件下，柱温箱设置30 ℃，35 ℃，40 ℃下，观察个组分分离情况，如图4、图5、图6所示，各组分分离度基本相似，但随着柱温升高，色谱柱的使用寿命会有所下降，因此将柱温箱温度设为30 ℃。

图4 柱温箱设置为30 ℃下色谱图

图5 柱温箱设置为35 ℃下色谱图

图6 柱温箱设置为40 ℃下色谱图

2.3 不同色谱柱的对比

Waters XBridge® BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色谱柱(下文以BEH色谱柱表示)，液相条件：流动相乙腈-水=55∶45，流速1.0 mL/min，柱温箱设置为30 ℃，示差折光检测器(RID)设置为40 ℃。HPLC Carbohydrate Analysis Column Aminex HPX-42A Carbohydtate Column 300 mm×7.8 mm色谱柱(下文以HPX-42A色谱柱表示)，液相条件：流动相为水，流速0.5 mL/min，柱温箱设置为85 ℃，示差折光检测器(RID)设置为50 ℃。钙柱，液相液相条件：流动相为水，流速0.5 mL/min，柱温箱设置为90 ℃，示差折光检测器(RID)设置为35 ℃。其中，HPX-42A色谱柱、钙柱的的液相条件由糖浆供应方提供。在进行样品检测时，为降低成本，本文并未购买麦芽五糖及以上的标准品，而是默认其按照保留时间依次出峰，采用面积归一化法进行定量计算，分析结果见表1。

表1 不同色谱柱对同一样品分析结果

如图7所示，使用BEH色谱柱时，糖浆原料中，各多聚麦芽糖分离完全，无峰重叠，但在聚合度>8以上时，色谱峰扁平，峰型相对较差，但在实际应用中，考虑到更多关注的是麦芽三糖，麦芽四糖的含量，最后高聚合度麦芽糖含量较低，影响较小。

图7 Waters XBridge® BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色谱柱

如图8所示，使用HPX-42A时，麦芽十糖及以下组分基本分离，但仍有重叠，尤其是麦芽六糖及以上多聚麦芽糖，重叠较为严重，而且色谱峰都有前沿现象。

图8 HPLC Carbohydrate Analysis Column Aminex HPX-42A Carbohydtate Column 300 mm Column色谱图

以上两种色谱柱虽然出峰顺序不同，但检测结果大致上相差不大的，可以通过比对简单地进行糖浆的验收，不至于完全受制于供应商的检测结果。

如图9所示，使用钙柱时，麦芽五糖及以上未能完全分离，而且与进样峰重叠在一起，并且麦芽四糖、麦芽五糖分离不完全，数据偏差较大，可供参考意义不大。

图9 钙柱色图谱

3 结论

使用高效液相色谱仪串联示差折光检测器(HPLC-RID)，采用Waters XBridge® BEH Amide 5 μm 4.6×250 mm Column色谱柱，流动相为乙腈∶水=55∶45，柱温箱温度设置为30 ℃，示差折光检测器(RID)温度设置为40 ℃，使用定性分析和面积归一化法相结合的方法，能基本计算出麦芽糖浆各个组分含量。糖果企业可参考该方法对原料糖浆进行验收，对糖浆的组分含量做到心中有数，从而在采购时掌握主动权。