姜黄素预防高糖诱导的H9c2细胞损伤的最适浓度筛选

卫小娟，李树德，黄映光，李青玲，李治纲，何水旺，李思熳*

(1.昆明医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学系，云南 昆明 650500；2.中国科学院 昆明动物研究所，云南 昆明 650201;3.云南省第一人民医院 普外一科，云南 昆明 650032)

中草药是我国传统医学的重要医用资源，也是千百年来我国无数医者理论和实践的积累，而关于中草药中特定成分及其治疗效果研究也成为基础医学的研究热点.姜黄作为传统中药，能行气破瘀，通经止痛.主治胸腹胀痛、肩臂痹痛、心痛难忍、产后血痛、疮癣初发、月经不调、闭经、跌打损伤[1].姜黄素(Curcumin，Cur)是姜黄根茎中主要的天然多酚.作为姜黄的主要提取物，其最初作为食品添加剂用于食品着色，而近年来的研究[2]表明其具有抗氧化、抗炎症的作用.姜黄素极低的毒副作用和广泛的生物活性，为研究临床疾病的治疗提供了新的方向.姜黄素除有抗癌作用外，对心血管系统、急性肺损伤、神经系统疾病、肾组织损伤和肝组织损伤均有良好的保护和缓解作用[3-23].

目前对姜黄素的药用研究主要集中在抗肿瘤作用上，已有研究[3-5]显示，姜黄素在前列腺癌、结肠癌、肾癌、非小细胞肺癌和白血病治疗中能诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖和迁移.除了具备抗肿瘤效果，多项研究[6-8]显示，姜黄素可以通过调节细胞增殖和凋亡，对心血管系统起到保护作用.糖尿病患者的心血管疾病往往由体内长期的高糖环境诱发，并多表现为细胞凋亡与坏死，但是姜黄素对高糖诱导的心肌细胞损伤的保护研究较少，且对于不同的细胞，姜黄素的最适作用浓度有所不同.在细胞凋亡过程中，Caspase与真核细胞凋亡密切相关，其中Caspase 3在细胞凋亡过程中有着举足轻重的位置，它是一种促进细胞凋亡的蛋白酶，它的作用底物很多，其中大部分可被Caspase 3水解[9-11].本研究旨在通过检测H9c2心肌细胞增殖活力和Caspase 3及活性片段Cleaved-Caspase 3的蛋白表达，筛选出姜黄素对高糖诱导的H9c2细胞损伤预防的最适浓度.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

姜黄素(C21H20O6)购自西安首禾生物科技有限公司，分子质量为368.39，以二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成 0.1 mol/L 储存液置于 4 ℃ 避光保存.二甲基亚砜(DMSO)购自Solarbio公司，CCK8试剂盒购自Biosharp公司，DMEM 低 NaHCO3基础培养基购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，0.25%EDTA胰蛋白酶购自Gibco公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海源培生物科技股份有限公司，青霉素-链霉素双抗溶液购自Gibco公司，GAPDH、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3抗体购自Affinity Biosciences公司，蛋白定量试剂盒(BCA 法)购自北京普利莱基因技术有限公司.

1.2 细胞培养

H9c2(2-1)大鼠正常心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库.将H9c2细胞接种于T75培养瓶中，加入含有10%FBS和1%双抗的DMEM低NaHCO3基础培养基，置于5%CO2培养箱中 37 ℃ 环境下培养，2～3 d 传代，稳定传代3次后，取细胞进行实验.

1.3 实验分组及细胞处理

实验分为正常组、模型组、4×10-6mol/L 处理组、8×10-6mol/L 处理组、12×10-6mol/L 处理组、16×10-6mol/L 处理组、20×10-6mol/L 处理组，实验各组处理详见表1.

表1 实验分组与处理

1.4 CCK8法检测细胞增殖活力

取稳定传代，生长密度达80%以上，且状态良好的H9c2细胞，弃上清，用PBS洗3次，胰酶消化并收集细胞，重悬，计数.调整细胞悬液，最终使96孔板中每孔细胞数在 5 000 个左右.然后将96孔板放入培养箱中，孵育 24 h 使细胞贴壁.按表1处理细胞，并设置空白组(无细胞)，每组6个复孔.处理完成后，弃去96孔板中原培养基，每孔加入1.0×10-4L 提前配好的含有CCK8的培养基(CCK8∶培养基=1∶10)，在5%CO2培养箱中，37 ℃ 环境下培养 4 h 后，使用酶标仪测其OD值(使用光源波长为 450 nm).收集数据并按照下式计算各组细胞的增殖活力：

细胞增殖活力=[(实验组OD值-空白组OD值)/(正常组OD值-空白组OD值)]×100%.

1.5 Western blotting检测凋亡蛋白的表达

按表1处理细胞后，弃去原培养基，使用PBS洗3次，胰酶消化后收集细胞；加入细胞裂解液与蛋白磷酸酶抑制剂混合物于细胞中，在冰上裂解 30 min，制成的蛋白样品采用BCA法检测蛋白样品的浓度，并用1Χ Buffer和无菌水将各蛋白样品浓度调整到同一浓度，100 ℃ 变性 10 min；每个泳道上样 3×10-5g，经10%SDS-PAGE电泳后，在半干转膜仪中将目标蛋白转移至PVDF膜上；用5%脱脂牛奶 37 ℃ 封闭 40 min；TBST洗膜，再用抗体稀释液根据说明书稀释的一抗常温孵育 30 min 之后，在 4 ℃ 环境下过夜孵育 8 h；TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)常温孵育 2 h；TBST洗膜，用ECL显影液对目的条带进行显影，GAPDH作为内参；使用Image J软件对图片进行扫描和分析.

1.6 形态学观察

选取生长状态良好的H9c2细胞弃上清，加PBS洗3次，胰酶消化并收集细胞，重悬细胞，并计数.调整细胞悬液，使细胞密度在5×105个/mL，每孔加细胞悬液 2 mL.将铺好板的6孔板放入培养箱中，孵育 24 h 使细胞贴壁.吸去原培养基，PBS洗3次，正常组和模型组分别加 1 mL 正常培养基，姜黄素4×10-6mol/L 处理组加入 1 mL 含姜黄素的培养基，培养 4 h.弃去培养基，PBS洗3次，正常组中加 2 mL 完全培养基，其他组中按 2 mL/孔分别加入含 0.1 mol/L 高浓度葡萄糖的培养基，培养 48 h.普通光学显微镜下观察细胞形态变化.

1.7 统计学处理

实验数据使用SPSS V17.0或Graphpad Prism 6.0软件分析，采用(平均值±标准差)表示.两组数据间使用独立样本t检验进行比较，两组以上的多组数据之间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示有统计学意义，以P<0.01表示有显著统计学意义.使用Graphpad Prism 6.0软件进行绘图.

2 结果

2.1 姜黄素对高糖诱导的H9c2细胞的增殖活力的影响

如图1所示，高糖处理的H9c2细胞增殖活力为(61.92±13.07)%；使用姜黄素预处理的H9c2细胞增殖活力，除12×10-6mol/L 处理组(58.78±6.27)%、16×10-6mol/L 处理组(61.91±12.97)%外，其余各组均有所上升，分别为：4×10-6mol/L 处理组(68.46±15.25)、8×10-6mol/L 处理组(68.67±17.69)%、20×10-6mol/L 处理组(62.66±17.26)%，但姜黄素各浓度组无统计学意义(P>0.05).

与正常组比##P<0.01图1 不同浓度姜黄素对H9c2细胞增殖活性的影响

2.2 姜黄素对高糖诱导的H9c2细胞的凋亡蛋白表达的影响

如图2结果显示，与正常组相比，模型组的Caspase 3的蛋白表达水平显著上调；与模型组相比，姜黄素各浓度组Caspase 3的蛋白表达水平显著下调；且随着姜黄素浓度升高 (4×10-6～16×10-6mol/L 范围内)，Caspase 3蛋白表达水平逐渐下调，但其浓度达到20×10-6mol/L 时Caspase 3蛋白表达水平又开始上调.

如图3结果显示，与正常组相比，模型组的Cleaved-Caspase 3的蛋白表达水平下调(P>0.05)；与模型组相比，姜黄素4×10-6mol/L 时Cleaved-Caspase 3的蛋白表达依然下调(P>0.05)；其他各浓度组相比于模型组，Cleaved-Caspase 3的蛋白表达均显著上调，12×10-6mol/L 时上调最明显.

(a)Caspase 3蛋白的表达 (b)Caspase 3蛋白表达的灰度值与正常组比##P<0.01，与模型组比**P<0.01图2 不同浓度姜黄素处理H9c2细胞中Caspase 3的蛋白表达水平

(a)Cleaved-Caspase 3蛋白的表达 (b)Cleaved-Caspase 3蛋白表达的灰度值与正常组比##P<0.01，与模型组比**P<0.01图3 不同浓度姜黄素处理H9c2细胞中Cleaved-Caspase 3的蛋白表达水平

2.3 不同处理条件下H9c2细胞形态变化

根据CCK8检测结果和WB结果，我们选择4×10-6mol/L 作为预防高糖诱导的H9c2细胞损伤的最佳作用浓度.观察细胞形态发现，正常组的H9c2心肌细胞形态呈梭形，均匀分布于培养皿中，且排列紧密，无异形；模型组中H9c2心肌细胞形态不规则、数量减少且分布不均匀，细胞间出现较大空隙；姜黄素4×10-6mol/L 处理组的H9c2细胞形态和数量恢复，细胞分布均匀、排列紧密，与正常组细胞形态无较大差异(图4).

正常组 模型组姜黄素4×10-6 mol/L处理组图4 H9c2细胞在不同处理条件下的形态变化(40×)

3 讨论与结论

对于不同的细胞或不同处理后的相同细胞，姜黄素的最佳作用浓度不同.有研究[24]显示，姜黄素可以降低EC9706和TE13细胞中p-STAT3的蛋白表达，且存在剂量依赖性.HOSSEINZADEH L[25]等人用不同浓度(5×10-6～50×10-6mol/L)的姜黄素预处理可使H9c2细胞通过产生ROS致敏DOX介导的凋亡.也有研究[7]显示，10×10-6mol/L 的姜黄素能够通过抑制H9c2心肌细胞内质网应激减弱棕榈酸诱导的细胞凋亡.在本研究中，前期通过CCK8结合WB结果，最终确定 4×10-6mol/L 为姜黄素对高糖诱导的H9c2细胞损伤预防的最适浓度.而形态学观察也发现 4×10-6mol/L 姜黄素处理组的H9c2细胞形态和数量恢复，细胞分布均匀，细胞排列紧密，与正常组细胞形态无较大差异.

综上所述，姜黄素可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增殖活力，缓解高糖诱导的H9c2细胞损伤.其中姜黄素浓度为4×10-6mol/L 时，对H9c2细胞具有最优的保护作用.本研究结果可为姜黄素在高糖诱导的H9c2细胞损伤治疗方面提供实验数据基础，也可为相关疾病的药物研发提供参考.